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    透射電鏡超薄切片和染色實驗
    實驗方法原理
    實驗步驟
    1. 取材 對一般的動物組織取材的要求如下:

    (1) 標本材料要新鮮,取材速度要快:由于生物組織離體后,細胞將會立即釋放出各種水解酶而引起細胞自溶,使其微細結構發生改變而產生假象,故要盡量保持材料的新鮮,經解剖、手術或活檢取材后迅速投入固定液內,以盡量保持細胞在活體狀態的結構。

    (2) 取材小,取材部位要準確:由于用于電鏡標本制備的固定液其滲透速度極慢,同時超薄切片的面積又很小,一般取材不超過 0.5-1mm3, 故取材時必須注意取材部位。如取材部位不當,則無法獲得預期的結果。

    (3) 所用的固定液及器材都必須預冷,以盡可能降低離體細胞內水解酶的活性,減少細胞自溶,一般均將固定液保存于 4℃冰箱內,取材用的剪刀或手術刀片及載玻片可置于冰塊上預冷。

    (4) 切割組織的刀、剪必須很鋒利,操作時避免拉、扯、鋸、壓等動作所造成的機械損傷。如果標本是病毒的分離培養物,則必須注意其數量、濃度。這種培養物取材后可用塑料離心管離心取其沉淀物,其量在離心沉淀后必須有米粒大小,如量太少,則無法進行以后的操作。取材的具體方法:根據所取的標本數量準備好潔凈的小瓶(瓶子必須經過嚴格的洗滌),在每只瓶上貼好標簽或編號,瓶內注入 4℃固定液 1-2ml。另外準備好潔凈的載波片及手術刀片及少量冰塊,將載波片置于冰塊上。組織離體后立即置于載波片上,并滴上幾滴 4℃的固定液,再用鋒利的刀片將組織切成 0.5~1 mm3的小塊,并立即投入到固定液中置于 4℃ 冰箱中固定。

    2. 固定

    (1) 固定方法:固定方法有物理的和化學的兩種。前者系采用冰凍、微波照射、臨界點干燥等手段來保存細胞結構;后者是用一定的化學試劑來固定細胞的結構,這些化學試劑稱固定劑,它能與蛋白質發生化學結合形成交聯,從而穩定細胞內的蛋白質,并能使脂肪、糖類保持生活時的狀態和位置,將精細的形態結構保存下來。組織通常多采用化學方法固定。理想的固定劑應具備如下條件:①能迅速而均勻地滲人細胞內部,立即殺死細胞以盡量減少「死后變化;②能穩定各種結構成分,以保證在后續的各種處理過程中不致溶解或流失;③能保存細胞的酶活力和抗原性,以供細胞化學或免疫細胞化學的測定母)不影響細胞的收縮或膨脹,以保持各種結構處于生活時的狀態;④不出現人工假象或變形,以保證電鏡圖像的真實性。為了達到上述要求,還必須重視固定液的 pH 值、滲透壓及電解質濃度等。

    3. 染色 具體染色方法:由于鈾和鉛具有不同的電子染色作用,故目前切片普遍都采用雙重染色法,即先用軸染色后,再用鉛染液染色。具體操作步驟:在干凈的培養皿內放置蠟板或經熔化的石蠟浸過的濾紙,將醋酸鈾染液滴在蠟板或用浸過的濾紙上,將撈有切片的載網覆于染液上(切片面接觸染液)染 15~30 min, 用雙蒸水沖洗切片、用濾紙吸干、再將載網覆于擰檬酸鉛染液上(為防止碳酸鉛沉淀的形成,可在培養皿內放入幾粒固體氫氧化鈉),染 5~10 min, 用雙蒸水沖洗切片,吸干,放入潔凈的培養皿內備用,電鏡檢查。

    注意事項
    取材的正確與否將與所制備的標本能否符合觀察要求密切相關,是超薄切片技術中的關鍵環節。

    固定目的:①盡膚保持細胞的結構在活體狀態;②在固定以后的漂洗、脫水和包埋時,保持細胞成份不致流失和溶解,并使組織適當的硬化,使組織細胞內各種物質的化學反應改變最??;③為標本以后的處理過程(包括染色和經受電子束轟擊)作準備。

    幾種常用固定劑:1) 鋨酸(Osmium tetroxide,OsO4鋨酸即四氧化鋨,是淡黃色塊狀或針狀結晶,熔點 40~41℃, 分子量 254.2, 溶于水、酒精、乙醚及氯仿。它的蒸汽有強烈刺激性,對人眼、鼻、喉粘膜有毒性作用,操作時應注意防護,最好在通風柜內操作。鋨酸為強氧化劑,對氮具有極大的親和力,能與蛋白質形成交聯,穩定蛋白質的各種結構成份而不產生沉淀。它對脂類有良好的保護作用,能與不飽和脂肪酸鏈結合,形成復合物,是唯一能固定脂類的固定劑。此外,高密度的金屬餓與被固定的組織成分結合,受到電子束照射時能散射大量電子,使圖像反差增大,起到“電子染色”的作用。鋨酸固定可避免組織塊收縮或膨脹,使組織塊軟硬適度,利于制作超薄切片。鋨酸的主要缺點是分子較大,對組織的滲透速度緩慢 (0.1~0. 3mm/h) 易產生固定不均勻,因此要求組織塊體積不超過 1mm3 。鋨酸對碳水化合物類固定效果不佳,使酶活性喪失較多,也會破壞抗原性,因此不宜用于酶細胞化學和免疫細胞化學研究。鋨酸固定液的濃度為1%, 固定時間為1~4h比如固定單層培養細胞則為 15~30 min 。

    2) 戊二醛(Glutaraldehyde,C5H8O2): 分子量為 100. 12 。沸點 73~75℃, 吸收光譜為280nm 。市售戊二醛為 25% 或 50% 的水溶液,其 pH 為 4.0~5.0 。多采用電鏡專用的精制戊二醛,長期貯存的戊二醛可因高溫、氧氣、中性或堿性 pH 發生聚合而失去醛基,固定效力也明顯降低,故戊二醛原液應保存于低溫處。已配制的戊二醛于 4℃保存。應盡量使用新鮮配制的戊二醛固定液。戊二醛對組織滲透力強,固定速度快 (0.4mm/h) 對細胞內結構有活躍的親和力,特別是對細胞內某些易變的結構,如微管、有絲分裂的紡錘絲以及細胞基質有較好的固定作用,它和蛋白質及氨基酸的反應是在溶液中通過與組織和蛋白質發生交聯作用,而使細胞成分得以穩定。它能保存糖元,固定核蛋白,能保存酶的活性,適用于細胞化學研究。戊二醛的另一優點是,被戊二醛固定的組織塊可在固定液中保存較長時間(數周甚至 1~2 個月)而不致有任何超微結構的改變這尤其適宜于遠距離以外臨床、實驗室或野外現場的取材保存。但戊二醛也非理想的固定劑,它不能保存脂肪,無電子染色作用,不能增加圖像反差,且對緩沖液滲透壓要求較高。目前固定大多采用戊二醛與鋨酸雙固定法,戊二醛作預固定,鋨酸作后固定,互相取長補短,固定效果較好。經戊二醛固定的組織須用緩沖液反復漂洗,否則殘留的戊二醛會影響鋨酸的滲透固定。戊二酸固定液的濃度微 1%~5%, 固定時間為 0.5~2 h 。

    目前,電鏡常用的超薄切片染色劑是鈾鹽和鉛鹽。鈾可與大多數細胞成分結合,特別易與核酸結合,而且染色較細致、真實、不易出現沉淀顆粒,但鈾具有放射性,使用時要特別注意。鉛對細胞和組織各種結構都有親和力,易與蛋白質結合,尤其是對不能被四氧化鋨染色的糖原具有染色作用。但鉛染色比較麻煩,鉛易和空氣中的 CO2 結合形成不溶性的碳酸鉛沉淀,污染切片。因此,在染色時要盡量避免染色與空氣中的 CO2 接觸。一般是在加蓋的染色平皿內放置一些 NaOH, 以減少鉛與空氣中二氧化碳的接觸。
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