原位雜交實驗所用探針
發布人：管理員 瀏覽次數： 發布時間：2018-12-18
雜交實驗所選擇的核酸探針可以分為兩種：克隆 的或合成的。實驗中，應根據不同的雜交實驗選擇相應的核酸探針。一般來說，可以選擇克隆的DNA或cDNA雙鏈探針。特別是當存在特異的克隆，或當DNA序列未知而又必須首先進行克隆以便繪制酶譜和測序時，常常選用克隆探針。
RNA探針也是一類很有前途的核酸探針，由于RNA是單鏈分子，所以它與靶核酸序列的雜交反應效率極高?？寺√结樢话惚裙押塑账?探針的特異性強，復雜性也高，并可獲得強的雜交信號。合成的寡核苷酸探針具有一些獨特的優點：
①由于鏈短，其序列復雜度低，相對分子質量 小，所以，和等量靶位完全雜交的時間較克隆探針短；
②寡核苷酸探針可識別靶序列內1個堿基的變化，因此短探針中堿基的錯配能大大降低雜交體的Tm值；
③可大量合成，價格廉價。
在分子雜交技術的發展早期，較多使用放射性同位素如32P、35S等來標記核酸探針，在相當一段時間內，放射性同位素被視為探針的傳統標記物且發揮著重要作用，它有十分明顯的優點如靈敏度高、特異性高以及方法成熟簡便。但隨著分子雜交技術的發展，它的缺陷也越發突出：半衰期短，必須經常標記探針：如32P半衰期只有14.2天，放射強度逐漸衰減。35S的半衰期可達88天，但衰變能量只有32P的1/10，靈敏度較低，只能用于多拷貝基因的檢測。3H的半衰期雖長達12.3年，但衰變能低，靈敏度太低。費用高：需要用進口試劑，價格高。檢測時間長：用放射自顯影需要較長的暴光時間。放射性同位素對人體有害，實驗室和環境容易被污染，放射性廢物處理困難。因此，推廣使用受到限制。
鑒于放射性標記探針在使用中的局限，促使非放射性標記核酸探針得以迅速發展，現在許多領域已用非放射性標記核酸探針取代放射性標記核酸探針，從而推動了分子雜交技術的發展和廣泛應用。目前，非放射性標記法可以分為兩大類：一類為酶促標記法，另一類為化學標記法。酶促標記法?？筛玫匦揎桪NA，以產生比非酶促法高的敏感性。其缺點是復雜、產量低、成本高，難以大規模推廣。
相比之下，化學標記法便宜而簡單，有些化學系統可將不同的檢測基因用相同的化學方法連接到DNA分子上。非放射性RNA探針很少用，因為大多數標記只適合于DNA探針。另外，RNA探針與DNA探針相比沒有明顯的優越性，而在標記、雜交和檢測過程中為了避免RNA降解還需要極為小心。
目前，應用最為多的非放射性標記物有三種：生物素、地高辛和熒光素。第一個被實際運用設計的非放射性標記DNA探針是生物素。這種早期探針的標記方法是通過酶促聚合作用將生物素標記的脫氧三磷酸核苷酸摻入到DNA中。雜交后，可以利用抗生物素蛋白或鏈菌抗生素蛋白-酶結合來檢測這些生物素標記的探針。
地高辛標記探針已有商品化試劑盒。地高辛作為一種半抗原，其修飾核苷酸的方式與生物素相似，也是通過一個連接臂將地高辛半抗原和核苷酸分子相連。標記的核苷酸可利用一種單一堿性磷酸酶聯抗體，經30~60 min溫浴即可達到與生物素標記探針相同的靈敏度，甚至更高。當要檢測內源性生物素比較高的組織如腸胃系統時，如果用生物素標記的探針進行雜交，其雜交信號將受到非特異性信號（內源生物素）的干擾，使其特異性降低。因此，目前地高辛的應用比生物素更廣泛。
RNA探針也是一類很有前途的核酸探針，由于RNA是單鏈分子，所以它與靶核酸序列的雜交反應效率極高?？寺√结樢话惚裙押塑账?探針的特異性強，復雜性也高，并可獲得強的雜交信號。合成的寡核苷酸探針具有一些獨特的優點：
①由于鏈短，其序列復雜度低，相對分子質量 小，所以，和等量靶位完全雜交的時間較克隆探針短；
②寡核苷酸探針可識別靶序列內1個堿基的變化，因此短探針中堿基的錯配能大大降低雜交體的Tm值；
③可大量合成，價格廉價。
在分子雜交技術的發展早期，較多使用放射性同位素如32P、35S等來標記核酸探針，在相當一段時間內，放射性同位素被視為探針的傳統標記物且發揮著重要作用，它有十分明顯的優點如靈敏度高、特異性高以及方法成熟簡便。但隨著分子雜交技術的發展，它的缺陷也越發突出：半衰期短，必須經常標記探針：如32P半衰期只有14.2天，放射強度逐漸衰減。35S的半衰期可達88天，但衰變能量只有32P的1/10，靈敏度較低，只能用于多拷貝基因的檢測。3H的半衰期雖長達12.3年，但衰變能低，靈敏度太低。費用高：需要用進口試劑，價格高。檢測時間長：用放射自顯影需要較長的暴光時間。放射性同位素對人體有害，實驗室和環境容易被污染，放射性廢物處理困難。因此，推廣使用受到限制。
鑒于放射性標記探針在使用中的局限，促使非放射性標記核酸探針得以迅速發展，現在許多領域已用非放射性標記核酸探針取代放射性標記核酸探針，從而推動了分子雜交技術的發展和廣泛應用。目前，非放射性標記法可以分為兩大類：一類為酶促標記法，另一類為化學標記法。酶促標記法?？筛玫匦揎桪NA，以產生比非酶促法高的敏感性。其缺點是復雜、產量低、成本高，難以大規模推廣。
相比之下，化學標記法便宜而簡單，有些化學系統可將不同的檢測基因用相同的化學方法連接到DNA分子上。非放射性RNA探針很少用，因為大多數標記只適合于DNA探針。另外，RNA探針與DNA探針相比沒有明顯的優越性，而在標記、雜交和檢測過程中為了避免RNA降解還需要極為小心。
目前，應用最為多的非放射性標記物有三種：生物素、地高辛和熒光素。第一個被實際運用設計的非放射性標記DNA探針是生物素。這種早期探針的標記方法是通過酶促聚合作用將生物素標記的脫氧三磷酸核苷酸摻入到DNA中。雜交后，可以利用抗生物素蛋白或鏈菌抗生素蛋白-酶結合來檢測這些生物素標記的探針。
地高辛標記探針已有商品化試劑盒。地高辛作為一種半抗原，其修飾核苷酸的方式與生物素相似，也是通過一個連接臂將地高辛半抗原和核苷酸分子相連。標記的核苷酸可利用一種單一堿性磷酸酶聯抗體，經30~60 min溫浴即可達到與生物素標記探針相同的靈敏度，甚至更高。當要檢測內源性生物素比較高的組織如腸胃系統時，如果用生物素標記的探針進行雜交，其雜交信號將受到非特異性信號（內源生物素）的干擾，使其特異性降低。因此，目前地高辛的應用比生物素更廣泛。
熒光素標記核酸探針也有商品化試劑盒，其敏感性與地高辛和生物素相似。特別是在近期，隨著染色體熒光原位雜交技術的迅猛發展，使得熒光素標記探針的開發和發展也有了突飛猛進的進步。
本文來自丁香園
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