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  • 口腔來源外泌體研究進展

    細胞和細菌都能夠分泌胞外囊泡,這些囊泡經過循環被其他細胞攝取,通過一系列的機制被完好保存,被稱為下面幾個不同的名稱:脫落的囊泡、外泌體(exosome)、膜囊泡(membrane vesicle,MV)、外膜囊泡(outer membrane vesicle,OMV)。外泌體這個術語首先是用于描述免疫細胞釋放的膜性囊泡,然后逐漸擴展到其他的細胞類型,包括腫瘤細胞。

     

    目前,外泌體是指從各種類型細胞中分泌的直徑為40100nm的細胞外囊泡。外泌體內含有來自細胞的脂質、蛋白質、核酸,通過質膜融合、表面受體介導的攝取、受體細胞內化等機制被裝載到受體細胞,影響其功能和活動。幾乎所有類型的細胞都能分泌外泌體,比如上皮細胞、樹突狀細胞、B細胞、T細胞、血小板等,從血漿、尿液、母乳、精液、羊水、唾液以及病理性的腫瘤積液中也可以分離出外泌體。

     

    外泌體具有多效的生物學功能,包括調節免疫活性、介導細胞間通訊和運送感染性物質等。外泌體中包含的RNAmiRNA可以隨外泌體轉移到另一個細胞,并在受體細胞中被翻譯,表明外泌體是遺傳交換的新載體。近年來,各領域都開始對外泌體展開研究,口腔領域主要對唾液、口腔癌和牙周致病菌來源的外泌體進行了研究,本文對其進行簡要綜述,總結口腔相關外泌體的研究進展。

     

    1.唾液來源外泌體

     

    唾液中含有多種分子和微生物,是局部和全身狀況的有效分析指標。血源性分子經由跨細胞或旁細胞途徑進入唾液,影響唾液的成分。有研究發現,唾液中的miRNA表達譜與血清中相似。唾液蛋白和牙周病、艾滋病以及自身免疫性疾病的關聯已經被證明。由于唾液收集具有非侵入性、低成本、簡單安全的特點,其內又含有對監測疾病有用的蛋白質,所以唾液是用于早期疾病診斷和監測的一種理想液體。用基于質譜分析的鳥槍法蛋白質組學方法研究發現,腮腺唾液的大部分蛋白質來自唾液外泌體。

     

    利用多維蛋白質質譜分析,在腮腺唾液外泌體中分離了491種蛋白質,其中有265種蛋白質與腮腺導管唾液中發現的蛋白質一致,72種與之前在尿液中分離的外泌體蛋白質一致,這些蛋白質與來自其他組織和細胞的外泌體蛋白也有部分一致?;蚍治龊?/span>KEGG通路分析發現,腮腺唾液外泌體蛋白質中胞質蛋白組成了大部分,這些蛋白質涉及磷脂酰肌醇信號系統、鈣信號通路、肌醇代謝、蛋白質輸出和信號轉導、質膜蛋白和上皮細胞信號傳導、T細胞和B細胞受體信號傳導、細胞因子受體相互作用以及抗原加工和呈遞等。因此,腮腺可以分泌反映腺體代謝和功能狀態的外泌體,這些外泌體攜帶的蛋白質可用于診斷和治療系統性疾病。

     

    用超速離心法提取分離全唾液的外泌體,微陣列分析顯示,509mRNA核心轉錄產物相對穩定地存在于外泌體中。在體外,熒光標記的唾液外泌體可與口腔角質形成細胞通信,將外泌體的遺傳信息轉移到角質形成細胞,改變基因表達。提示唾液外泌體中的mRNA可用于疾病診斷。唾液外泌體miRNA作為一種診斷標志可避免來自死細胞或者唾液中其他免疫細胞的核酸干擾造成的假陽性結果。有研究比較了16例口腔扁平苔蘚患者和8名健康對照者的唾液外泌體miRNA譜,微陣列分析和定量PCR分析顯示,miR-4484在唾液外泌體中顯著上調,這提示miR-4484可能是口腔扁平苔蘚(萎縮型、糜爛型)的潛在生物標志物。

     

    Machida等在無刺激的情況下收集15名年輕人和13名老年人的全唾液,分離外泌體,提取RNA,比較唾液外泌體RNA的變化。該研究通過微陣列分析檢測到242miRNA,其中6miRNA有明顯的變化,進一步通過實時定量PCR驗證,唾液外泌體中的miR-24-3p可能是衰老的一個生物標記物。所有年齡相關的疾病都與衰老有關,這些疾病相互影響,時間的推移本身并不是老化的最佳衡量標準,老化生物標志物的發展對于明確衰老和疾病過程很重要。

     

    唾液外泌體中的miRNA也可以成為疾病治療的靶標。ebv-miR-BART13-3p是一種功能性miRNA,可通過外泌體從B細胞轉移到唾液上皮細胞中,下調STIM1蛋白,影響唾液分泌所需的關鍵Ca2+進入機制;ebv-miRBART13-3p也下調AQP5的表達,AQP5是位于極化的人唾液腺腺泡細胞頂端膜上的重要水通道。研究表明,ebvmiR-BART13-3p與唾液分泌喪失有關,外泌體負載的ebv-miR-BART13-3p可能是改善舍格倫綜合征患者口腔干燥癥的治療靶標。還有研究發現,外泌體負載間充質特異的成熟miRNA,從間充質向上皮傳遞遺傳基因。

     

    小鼠下頜下腺來源的外泌體,負載miR-133b-3p,可以從間充質轉移到不表達miR-133b-3p的唾液上皮;在外泌體中敲除miR-133b-3p,可以減少上皮kit陽性祖細胞的增殖,增加DIP2B的表達。DIP2B涉及DNA甲基化等過程,外泌體從間充質到上皮的過程中攜帶miR-133b-3p,可以減少DIP2B的表達,影響祖細胞的擴增,這提示外泌體介導的上皮間充質轉換過程可能成為誘導受損成人器官再生的靶標。

     

    目前,還傾向于研究唾液外泌體與遠端疾病如何相關聯。唾液來源外泌體內包含有可能影響免疫應答的二肽基肽酶Ⅳ(DPPⅣ)、半乳糖凝集素-3和免疫球蛋白A,這些囊泡可能參與生物活性肽的分解,在口腔局部免疫防御中發揮調節作用。有研究通過在體外建立乳腺癌模型發現,乳腺癌來源的外泌體可以被唾液腺細胞攝取,激活唾液腺細胞的轉錄機制,從而在轉錄和蛋白質組學上改變唾液外泌體的成分。還有研究發現,胰腺癌小鼠唾液外泌體可以與NK細胞直接作用,降低NK細胞的殺傷能力,導致NK細胞的抗腫瘤免疫逃逸,這為腫瘤的發展過程提供了一個新的見解。

     

    2.口腔癌來源外泌體

     

    腫瘤細胞來源的外泌體正在成為早期檢測和控制人類癌癥的潛在工具。一些研究證明,腫瘤細胞來源的外泌體可以通過誘導腫瘤細胞凋亡或增強抗腫瘤免疫而具有抗腫瘤特性。另有研究發現,腫瘤細胞來源的外泌體具有免疫抑制性,可以刺激腫瘤細胞增殖或誘導耐藥性,促進腫瘤進展、侵襲和轉移。頭頸部鱗狀細胞癌是第七大常見的惡性腫瘤,年發病率大于60萬分之一,其中有一半位于口腔。盡管治療方法和技術取得了顯著的進展,在近20年來,其5年生存率一直在50%左右,而且容易復發,原位癌復發率約為10%30%,轉移癌發生率高達30%。

     

    雖然頭頸部鱗狀細胞癌是一種潛在的可治愈的惡性腫瘤,并且具有早期診斷的特征,但患者往往發現時已經被診斷為接近癌癥晚期的類型,因此迫切需要發現一種新的口腔癌診斷模式??谇击[狀細胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)患者唾液來源外泌體可用來探索OSCC前期和早期的進展。納米粒子跟蹤分析顯示,OSCC患者唾液來源外泌體比健康人唾液來源外泌體每毫升有更高濃度的納米顆粒和模式納米顆粒尺寸;用ELISAWestern檢測外泌體標記物顯示,CD63表達升高,CD81CD9表達降低。

     

    OSCC患者唾液來源外泌體在形態和分子結構上與健康人唾液來源外泌體不同,這提供了一個基線數據,可以利用外泌體來監測OSCC的早期變化。而且,用原子顯微鏡觀察發現了更細微的變化。用高分辨力原子顯微鏡觀察發現,口腔癌患者的唾液中含有更多的外泌體,形態不規則,大小增加,囊泡內聚增加;對于單個的外泌體來說,口腔癌患者唾液外泌體表面標記物CD63密度增加。

     

    超靈敏的低原子力顯微鏡可以顯示亞結構組織,OSCC患者唾液單個外泌體顯示出可逆的機械變形,具有70100nm三角膜形態特殊跨膜受體的亞結構。以上這些提示,外泌體的定量納米形態學、生物力學和表面生物分子性質可以用于OSCC監測以及開發新的細胞遞送系統。除了可以作為OSCC早期監測指標,OSCC外泌體也參與其侵襲和轉移。OSCC細胞來源的外泌體能夠被OSCC細胞自身吸收,并且通過活化PI3K/Akt、MAPK/ERKJNK-1/2途徑,顯著促進腫瘤增殖、遷移和侵入。

     

    PI3K、ERK-1/2JNK-1/2的藥物抑制劑可以明顯減弱這個過程。用來自高度侵襲性的舌癌細胞SQUU-B的外泌體處理非侵襲性的舌癌細胞SQUU-A發現,外泌體介導的相互作用決定了OSCC的侵襲性和器官性轉移;經過測序分析后發現,外泌體中的miR-200c-3p調控了OSCC細胞的侵襲。外泌體也可通過與腫瘤周圍基質組織溝通來促進腫瘤增殖和血管生成,激活預轉移的位點。外泌體是腫瘤微環境的重要組成成分,對正常和缺氧OSCC來源的外泌體進行miRNA測序顯示,低氧條件下改變最顯著的miRNAmiR-21。

     

    降低外泌體中的miR-21水平,可顯著降低腫瘤細胞的遷移和侵襲。外泌體中的miR-21可增強OSCC細胞波形蛋白的表達,降低E-鈣黏蛋白水平。循環外泌體的miR-21水平與OSCC患者的HIF-1α/HIF-2α表達、T分期和淋巴結轉移密切相關。提示來源于缺氧環境的OSCC外泌體以HIF-1α和HIF-2α依賴性方式增加OSCC細胞的遷移和侵襲,缺氧微環境可能刺激腫瘤細胞產生富含miR-21的外泌體,將其遞送至含氧量正常的細胞并促進其轉移。因外泌體參與OSCC的侵襲和轉移過程,阻斷外泌體的攝取途徑可能對癌癥治療有效,硫酸乙酰肝素蛋白多糖(HSPGs)是癌細胞的外泌體受體,其攝取途徑與外泌體的生物學活性高度相關,肝素可有效抑制HSPGs攝取外泌體,從而抑制腫瘤發展。

     

    有研究顯示,向小鼠體內植入異種移植物腫瘤,OSCC細胞來源的外泌體可以促進腫瘤的生長,而應用肝素抑制了腫瘤對外泌體的攝取,減弱了腫瘤的生長速率,因此,OSCC細胞衍生的外泌體可能是一種新的腫瘤治療靶點。

     

    3.牙周致病菌來源外泌體

     

    除了細胞來源的外泌體,細菌也可以分泌外泌體,稱為外膜囊泡(OMV)。細菌可通過釋放OMV來增強毒力。通過OMV,細菌不需要和靶哺乳動物細胞接觸即可將宿主細胞暴露于相對高濃度的毒素和額外的毒力因子中,這為細菌侵入宿主造成的免疫反應研究提供了新的方向。用牙周致病菌牙齦卟啉單胞菌來源的OMV刺激牙齦成纖維細胞和人臍靜脈內皮細胞,OMV以劑量依賴的方式顯著抑制培養的牙齦成纖維細胞和人臍靜脈內皮細胞的增殖,OMV還抑制人臍靜脈內皮細胞毛細血管的形成,提示OMV可通過抑制牙周組織中的細胞增殖和血管再生促進慢性牙周炎。

     

    在慢性牙周炎中,OMV可能是局部和全身炎癥刺激的重要來源,其通過將生物活性毒素和額外的毒力因子遞送到牙周組織的易感細胞中而在牙周病中起作用。在具體的影響機制方面,有兩方面的報道。其一,A型伴放線聚集桿菌分泌的OMV可以將多種蛋白質傳送至HeLa細胞和人牙齦成纖維細胞,OMV可以被內化到HeLa細胞和人牙齦成纖維細胞的核周區域,共定位分析顯示,內化的OMV與內質網共定位并攜帶抗原。

     

    伴放線聚集桿菌OMV的脂質成分主要是脂多糖,宿主通過內化OMV,在細胞內部暴露于來自完整囊泡或破裂囊泡的肽聚糖或者脂多糖片段中。來自霍亂弧菌、幽門螺旋桿菌、銅綠假單胞菌和淋病奈瑟球菌的囊泡被證明將肽聚糖或者脂多糖遞送至宿主細胞,可以激活核苷酸結合寡聚化結構域蛋白質1NOD1)和NOD2,NOD1NOD2NOD樣受體(NLR)家族成員。NOD1NOD2被證明是哺乳動物先天免疫中細菌感染的關鍵細胞內傳感器,通過激活核因子NF-κB誘導免疫應答和消除細菌,并產生嗜中性粒細胞募集。

     

    NOD1NOD2在各種細胞類型的口腔組織(例如上皮細胞、牙齦成纖維細胞和牙周韌帶細胞)中功能性表達。已經發現A型伴放線聚集桿菌的OMV在人類胚胎腎細胞中可作為NOD1-NOD2-依賴性NF-κB活化的強誘導劑,因此,A型伴放線聚集桿菌的OMV可以內化到人類細胞中,并傳遞部分激活NOD1NOD2的抗原,有助于細菌外囊泡誘導的整體炎癥反應。其二,miRNA是真核生物基因表達的主要調節者,但關于和miRNA相似大小的細菌miRNAmsRNA)研究很少。msRNA約為1520個核苷酸的長度,有研究從牙齦卟啉單胞菌、伴放線聚集桿菌、齒垢密螺旋體中分離了msRNA,而且發現OMV分泌了這些msRNA,細菌的RNA可通過OMV被傳遞到真核生物。

     

    實驗發現,外源性msRNA可抑制JurkatT細胞中某些細胞因子的表達,提示msRNA可能作為新型細菌信號分子介導細菌與人相互作用,為牙周致病機制提供新的見解。OMV也被用作疫苗的研究,牙齦卟啉單胞菌來源的OMV可作為牙周疫苗的免疫抗原。OMV被證明有蛋白酶抗性,能夠經受長期的存儲,其結構穩定性有利于攜帶內容物進入宿主免疫系統。通過鼻內接種疫苗的方法向小鼠體內接種OMV,可以在小鼠血液和唾液中產生牙齦卟啉單胞菌特異性的抗體,而且通過添加TLR3激動劑PolyIC)這種反應顯著增強。

     

    OMVPolyIC)共同刺激的小鼠血清不僅對疫苗株牙齦卟啉單胞菌(ATCC33277)而且對異種株牙齦卟啉單胞菌(W83W50)的牙齦卟啉蛋白水解活性顯示出抑制作用。經OMVPolyIC)小鼠免疫血清預培養后,牙齦卟啉單胞菌的活力下降,而這種血清熱滅活后其殺傷作用被部分阻斷。用OMVPolyIC)免疫的小鼠唾液樣品增強了疫苗株和異種株的細菌凝集。在口腔感染的小鼠模型中,與僅PolyIC)免疫的小鼠相比,用OMVPolyIC)免疫的小鼠口腔中牙齦卟啉單胞菌的數目顯著減少。在用OMVPolyIC)鼻內免疫的小鼠中引起高水平的血清IgG(包括IgG1IgG2a)和唾液S-IgA,免疫后分別維持至少28周和18周。

     

    在近端器官鼻內免疫接種和腦內注射實驗中檢查OMV的積累證實了OMV的安全性。提示在牙周細菌清除方面,使用OMVPolyIC)進行鼻內免疫是一種可行且安全的疫苗策略。

     

    4.總結和展望

     

    口腔領域對外泌體的研究主要集中在外泌體介導細胞間通訊和調節免疫活性方面。唾液來源外泌體中含有唾液中的蛋白質和miRNA,而唾液外泌體穩定存在的特點,使得唾液外泌體能夠成為理想的疾病監測標記物,唾液外泌體的具體形態是OSCC早期監測的一個新方向;而且,不論是唾液外泌體還是OSCC細胞來源的外泌體在腫瘤發展過程中都起了作用,同時也可以是疾病治療的潛在靶點。牙周致病菌來源的外泌體是牙周免疫的一個新方向,也可以被用作牙周疫苗的開發。外泌體研究在口腔領域是一個新的方向,為口腔疾病的治療和診斷提供了新的思路,同時也需要更多更深入的研究,以期未來能夠造福于臨床。

     

    來源:史亞方,彭文英,林莉.口腔來源外泌體研究進展[J].中國實用口腔科雜志

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