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    一文掌握 BrdU標記法檢測細胞增殖

           細胞增殖檢測已經廣泛應用于分子生物學、腫瘤生物學、免疫學和大規模藥物篩選等研究領域。


    檢測方法主要分為兩類:

    • 一類是直接測定進行分裂的細胞數來評價細胞增殖能力,如Ki67、BrdU以及EdU細胞增殖檢測等;

    • 一類是通過測定活性細胞數目來間接反映細胞增殖能力,如MTT、CCK-8等。

    具體實驗可參考:

          1、實驗專欄丨這5年做MTT實驗的總結都在這兒了

          2、實驗專欄丨一文掌握CCK-8細胞增殖與毒性檢測法


          直接測定DNA合成是細胞增殖檢測的最準確方法之一,是測定物質毒性、評估藥物安全評價、細胞健康的基本方法,其中常用的方法有BrdU標記法。

    BrdU檢測原理


           用BrdU預處理的細胞中,BrdU可代替胸腺嘧啶核苷插入復制的DNA雙鏈中,而且這種置換可以穩定存在,并帶到子代細胞中。細胞經過固定和變性處理后,可用免疫學方法檢測DNA中BrdU的含量(如采用鼠抗BrdU單克隆抗體特異識別BrdU,再采用辣根過氧化酶標記的山羊抗鼠IgG二抗標記,最后用比色法或熒光的方法進行定量測定),從而判斷細胞的增殖能力。


    實驗步驟


           1.細胞以1.5×105 /ml細胞數接種于直徑35 mm培養皿中(內放置一蓋玻片),培養1 d,用含0.4%FBS培養液同步化3 d,使絕大多數細胞處于G0期。

           2.加入BrdU(儲液:1.0 mg/ml,終濃度為0.03 μg/ml),37℃,孵育40min。

           3.棄培養液,玻片用PBS洗滌3次。

           4.甲醇/醋酸固定10 min。

           5.經固定的玻片空氣干燥,0.3%H2O2-甲醇30 min滅活內源性氧化酶。

           6.5%正常兔血清封閉。

           7.甲酰胺100℃,5 min變性核酸。

           8.冰浴冷卻后PBS洗滌,加1抗即抗小鼠BrdU單抗(工作濃度1:50),陰性對照加PBS或血清。

           9.按ABC法進行檢測,蘇木素或伊紅襯染,在顯微鏡下隨機計數10個高倍視野中細胞總數及BrdU陽性細胞數,計算標記指數(LI)。


    注意事項


           1.BrdU配制方法:10 mg溶于10 ml雙蒸水,4℃下避光保存

           2.BrdU會肌體造成不可逆損傷,使用時注意安全,避免吸入BrdU粉塵。



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