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    你真的用Image J測到了WB條帶灰度值嗎?

           關于用Image J量化westernblot條帶灰度值,在網上一直盛傳著兩種操作方法,然鵝~小伙伴們卻一直不確定到底哪種才是正確的測量灰度方法,甚至將灰度與光密度弄混淆。今天咱們一起就這個機會學習下,請先看看你是用以下哪種方法測量灰度值?以下是兩種方法的具體操作。


    方法一


           1、打開Image J軟件→左上角file→Open 選擇自己的條帶圖片(事先把條帶擺正)


           2、把圖片轉化成灰度圖片:Image→type→8-bit


           3、第一個矩形工具→選上所有條帶



           4、analyze→Gels→select first lane→Gels→plot lanes(在這第四步也可以分開選取,如:框選第一個條帶→analyze→Gels→select firstlane→將第一個框拖移到余下條帶→Gels→select nextlane)


           5、選中直線工具,將開口波峰關閉



           6、選中魔棒工具(正數第七個),點擊波峰,就得出所有area值。



    方法二


           1、打開Image J軟件→左上角file→Open 選擇自己的條帶圖片(事先把條帶弄正)


           2、把圖片轉化成灰度圖片:Image→type→8-bit


           3、扣除背景:Process→Subtract Background→50pixels 并勾選Light Background



           4、設定參數:Analyze→set measurement→勾選Area、Mean gray value、Min & max gray value、Integrated density

           5、Analyze→set scale→unit of length選項里改為pixels,確定



           6、圖像分割。Edit→Invert→選中橢圓圈(手殘黨首選)/不規則圓圈(心靈手巧黨義無反顧),手動圈上單個條帶



           7、Analyze→Measurement即得到Intden,重復6、7步就得到所有Intden值

           小伙伴們,你們是哪種方法呢?首先先把結論說出來,其實兩者得出的area和Intden嚴格來說都不是灰度值,前者是面積而后者是光密度值,但用來量化WB條帶都是OK的。


           Image J這個軟件在將western blot條帶量化時存在兩種參數:灰度與光密度(假,暫且這么稱呼,原因下文再說),這兩者在理解使用Image J量化WB條帶十分重要,請務必仔細看以下幾個概念。


           1、灰度(gray):是指圖像中各種顏色的深淺程度, 它以整數值表示, 一般的圖像分析軟件將圖像每個像素點的顏色分為 0-255共 256 級,每一像素點對應的數值即灰度,灰度值越小物體顏色越深。有興趣的小伙伴,可以隨意用Image J打開一張圖片,光標在圖片上任意移動,得到的value值最小為0(純黑),最大為255(純白)。


           2、光密度(OD,真):也就是吸光度(A), 光線通過溶液或某一物質前的入射光強度Io與該光線通過溶液或物質后的出射光強度Ib比值的對數OD=lg(Io/Ib),其實就是大家熟悉的分光光度法的朗伯比爾定律。


           明確這兩個概念后,我們再來看為什么稱Image J里的光密度是“假”,因為在圖像分析中的光密度(假)是由灰度值再經計算得到的, 它是一個相對值, 但其算法與 OD 值的算法類似。只是它的入射光強度由Western blot膠片上最亮區域的平均灰度值代替, 而出射光強度則由待測目標平均灰度值代替。


           即:圖像分析系統的光密度值=lg(WB膠片上最亮區域的平均灰度值/ 待測目標的平均灰度值),再簡單點來說,就是光密度(假)和正兒八經的灰度值有血緣關系。


           總結起來說灰度與光密度(假)都能用來量化western blot條帶,兩種量化任君隨意挑。


    現在說回兩種操作方法:


    方法一:

           是通過每個條帶上眾多像素點對應的灰度值勾畫出一條曲線,最后魔棒點出算出的area值其實就是該條帶所對應的面積大小。條帶越大,area值越大。


    方法二:

           是通過上文說到的光密度(假)計算方法得出來的,最后得出的Intden值是所圈面積下的總光密度值,再除以圈下面積area,得出的是平均光密度值(圖像中陽性區域每一像素點的 OD 值疊加后除以測量的面積)。條帶(顏色反轉后)越白越亮則Intden/area越大。


           所以嚴格意義上來說,方法一方法二最后得出的數據都不屬于正兒八經的灰度值,但又與灰度值有著千絲萬縷的聯系。如果只是量化WB條帶,兩種方法是都能選用的,記得標注你得到的結果是area還是Intden,但如果你想測出真正的灰度值,那么我們下節課再來好好談談,咦?我說話怎么越來越像老師的風格呢,哈哈,同學們,下課!


           ▍來源:實驗萬事屋

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