CRISPR/cas9為基礎的基因篩選為生物學問題的探究提供了新的工具好思路，通過簡單的改變sgRNA，我們可以將cas9引導到基因組的不同位置。但是sgRNA存在著不同的on-target活性和off-target問題。

       那么如何根據篩選得到結果，預先確定一些有效的sgRNA？

       今天帶大家一起走進David E Root課題組的工作，了解統計分析在sgRNA確定上的神奇與偉大。很多研究目前已經確定Cas9 脫靶的活性同時依賴于sgRNA的序列和不同的實驗條件。這些研究為初步了解脫靶問題提供了一定的研究基礎，然而關于sgRNA脫靶的主要定量模型并未得到解析。

       這里David E root課題組則通過基于前人發表的Human和mouse screen的結果，對于sgRNA進行的統計分析，提出了sgRNA活性和脫靶性的預測模型。

       首先我們來看看2014年該課題組通過針對于不同基因設計的密鋪sgRNA，進而評價sgRNA活性的工作。

       為了發現影響sgRNA效率活性的序列特征和target區域特征，科學家們的策略是通過針對于細胞表面marker，進行sgRNA的設計，通過密鋪設計所有可能的sgRNA，科學家們通過一個細胞遞送一個sgRNA，然后通過FACS分離biallelic敲除細胞，然后通過測序，獲得最高活性的sgRNA。

       首先科學家們在EL4細胞系，老鼠胸腺細胞系進行的探究。經過9天的轉導，對于內源性表達的Thy1，H2-K，Cd45, Cd43, Cd28，Cd5進行分選富集敲除細胞。在人的細胞系中則選取了MOLM13，NB4和TF1通過轉導Cas9進而通過篩選富集活性sgRNA。

       接下來，科學家們對所有的sgRNA在基因組的位置進行了注釋，如下圖，我們可以拿到在靠近前面extron位置的sgRNA活性會更高。

       一些exon區域的sgRNA并未有活性，因此暗示這些exon并未表達在相應的細胞系中。同時在CD15的N端活性則不是很高，很有可能由于不同的局部表觀遺傳學修飾的影響。在獲得sgRNA位置特征后，科學家們的目光轉移到CDS區，期望能從中獲得sgRNA序列特征。

       如以前發現，過高或過低的GC含量都會導致活性的降低。

       科學家們發現，在sgRNA20號位置的sgRNA更傾向于G而排斥C，在16位置的sgRNA則傾向于C排斥G，在sgRNA的中間區域存在A活性更高。不僅如此，科學家還發現針對于sgRNA的PAM區域，則CGGT的活性最高。針對于以上可提出來的準則，科學家們，則提供了sgRNA的活性的預測。

網址：

       http://www.broadinstitute.org/rnai/public/analysis-tools/ sgrna-design