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    小鼠胚胎干細胞培養實驗步驟

    1、一般培養——保持胚胎干細胞處于未分化狀態

    培養基
          細胞復蘇
          凍存細胞
          明膠包被
          細胞傳代

    2 、體外分化

    培養基:包被有多聚鳥氨酸/纖維結合蛋白的培養板(使用或不使用蓋玻片)

    體外分化方法

    注:以下培養針對于小鼠的R1胚胎干細胞系,其它胚胎干細胞的培養可以參考。不過人的胚胎干細胞培養不可以采用下面的protocol,需要用專用的protocol和培養基。

    一般培養——維持ES細胞處于未分化狀態

    ES細胞培養用含有LIF(白血病抑制因子)和Feed細胞的培養基(高糖)來阻止細胞的分化。為細胞提供包被有0.1%明膠的平板作為粘附細胞的基質。建議每2-3天從達到80%-90%融合的平板按1:8的比率傳代細胞一次,細胞傳代以后,在將細胞接種在0.1%明膠包被的培養皿之前,通過預先將細胞接種在沒有經過包被的組織培養板2個小時,使分化細胞粘附,從而將分化和未分化細胞分開。將細胞全程置于37℃,5%CO2,100%濕度條件下培養。如果在Feed細胞,那么就需要采用MMC進行處理,抑制Feed細胞增殖,但仍然能保持其分泌LIF因子的活*。下文中暫不提及Feed細胞。Feed細胞可以來源于STO細胞或原代胚胎成纖維細胞。

    培養基

    ES:配制一20×不含DMEM,HS,LIF的溶液(該溶液也能用于EB培養基--見下文)。分裝在50ml 離心管中,(稀釋為2×,每管42ml),貯存在-20℃。通過將21ml該溶液,HS和LIF加入450ml DMEM中制備培養基,0.22 μm濾膜過濾。貯存于4℃,時間不要超過2周。

    貯存液
          DMEM(高糖)
          馬血清(HS)
          L-谷氨酰胺(200mM)
          MEM NEAA(10mM)
          HEPES(1M)
          β-巰基乙醇(55Mm)
          PEST
          LIF

    復蘇細胞

    細胞被凍存在10%二甲基亞砜(DMSO)中防止結晶的形成,結晶的形成會損害細胞。然而,二甲基亞砜對細胞有毒*,快速的進行細胞復蘇是很重要的。

    步驟:

          1、從液氮中取出一管細胞;
          2、將凍存管置于37℃水浴中2分鐘(或放到管內溶液恰好完全溶解);
          3、將細胞轉移到一15ml Falcon管中;
          4、加入5ml ES培養基(用培養基沖洗凍存管);
          5、離心3分鐘;
          6、棄上清,用2ml ES培養基重懸細胞,至少吹打10次;
          7、種在明膠包被(見下文)的6孔或6cm組織培養皿;
          8、孵育。

    凍存細胞

    凍存液:90%HS和10%DMSO

    步驟:

    1、1×PBS洗細胞并留少許PBS在培養皿內;
          2、用細胞刮刀收集細胞;
          3、將細胞轉入15ml 離心管管內并離心3分鐘;
          4、棄去上清并將細胞重懸于冷的凍存液中(10 cm的培養皿用2ml,15cm的培養皿用6-7ml。)
          5、分裝于凍存管內,每管1ml;
          6、置-80℃過夜,第二天移入液氮。

    Geltin(明膠)包被

    準備500ml 0.1%geltin溶液

    1、將0.5 g明膠溶解在500ml無鈣鎂的PBS中(50-65℃水浴15~30分鐘)。
          2、最好在溶液沒有冷卻的情況下通過0.22 μm濾膜過濾,貯存在4℃。

    包被培養板或培養皿

    1、加入足量的明膠溶液覆蓋培養平面(15 cm培養皿加2ml,10 cm培養皿加0.5~1 ml,溶液的量并不重要,只要能完全覆蓋培養表面就行了。);
          2、置室溫30分鐘;
          3、去除明膠溶液,將培養板貯存在包裝袋中室溫放置,最好將板子平放或倒扣,以免明膠污染蓋子和流出培養板。

    細胞傳代

    建議每2天傳代細胞一次,過度生長的細胞會降低細胞的自然分化率,我們建立了一種純化方法來去除分化細胞,在將細胞接種在明膠包被的培養板上之前,通過將分化細胞黏附在沒有包被的組織培養板上去除分化細胞。

    純化步驟包含在下面的方法中。
          1、去除培養液;
          2、無鈣鎂PBS(Gibco)洗滌;
          3、加入胰酶EDTA(Gibco)。37℃孵育5分鐘。
          4、加入ES培養基使胰酶失活;
          5、將細胞轉入15 ml離心管中離心3min;
          6、去除上清,將細胞重懸于2 ml ES培養基,至少吹打10-20次。如果加入培養基的量較少會比較容易將細胞團弄散分開。ES細胞有聚集成團的傾向,傳代過程中仔細將細胞弄散分開很重要。這樣可能會減少細胞的自然分化。
          7、將細胞接種在沒有包被的組織培養皿中(使用和一開始同樣規格的培養皿)放入溫箱2小時(分化細胞在該時間內將黏附,而ES細胞仍將保持懸?。?;
          8、含有細胞的培養基轉入geltin包被的組織培養皿。吹打以確保細胞被分散開(前面已經提到--ES細胞有聚集成團的傾向)
          9、建議按1:4-1:10的比率傳代 (ATCC)

    保持細胞的傳代比率很重要,以我們的經驗,1:8的比率是好的,可以使細胞的自然分化降到最低。當你使用不同規格的培養板進行細胞傳代可以使用表1來計算傳代比率。

    體外分化

    胚胎干細胞在體內外可以分化為各種類型的細胞。我們的體外分化方法有利于神經前體細胞通過在最少量的培養基內選擇(第3步),在有bFGF存在的情況下擴增(第4步)并最終分化在第5步。細胞全程培養在37℃,5%CO2,100%濕度條件下。一般體外誘導向神經細胞方向分化,也可以采用低濃度的RA進行誘導。

    時間線(總時間為27~34天)

    第2步;4+1天 第3步;4-10天 第4步;4天 第5步;10-15天

    體外向心肌細胞方向分化

    胚胎干細胞在體外去除LIF情況下會自然向心肌細胞方向分化,小鼠的R1系一般在第7-8天自然出現搏動的心肌細胞,與胚胎發育時間線是完全一致的。

    培養基

    EB

    配制一20×不含DMEM,FBS,LIF的溶液(該溶液也能用于ES培養基--見前述)。分裝在50ml 離心管中,(稀釋為2×,每管42ml),貯存在-20℃。將21ml該溶液和50ml FBS加入450mlDMEM中制備培養基,0.2μm濾膜過濾。貯存于4℃。

    貯存液
          DMEM(高糖)
          胎牛血清
          L-谷氨酰胺(200mM)
          MEM NEAA(10mM)
          HEPES(1M)
          β-巰基乙醇(55Mm)
          PEST(P104U/mlS104μg/ml

    ITSFn and N3(分化培養基):
          配制一20×不含DMEM/F12的溶液。分裝在15ml 離心管中,(稀釋為1×,ITSFn 7.05ml,N3 12.55ml),0.2μm濾膜過濾,貯存在-20℃。將該溶液加入DMEM/F12中制備培養基,貯存于4℃。

    貯存液
          DMEM(高糖)
          轉鐵蛋白50mg/ml
          胰島素5mg/ml
          亞硒酸鈉300μM
          黃體酮(20μM)
          腐胺(100μM)
          PEST(P104U/ml S104μg/ml)
          層粘連蛋白100μg/ml
          纖維連接蛋白250μg/ml
          堿*rhFGF, 10μg/ml
          *在第4步將bFGF加入N3培養基使終濃度為10ng/ml。
          ITSFn and N3培養基貯存液的準備

    使用無菌的溶劑和稀釋液,在分裝之前要對溶液進行過濾,如果因為某些原因溶液在分裝之前沒有進行過濾,需要在管子上標明以便別人在使用時知道該溶液不能直接用于細胞培養。

    貯存液  溶劑,貯存液,稀釋劑和儲存
          轉鐵蛋白50mg/ml
          胰島素5mg/ml
          亞硒酸鈉300μM
          黃體酮(20μM)
          腐胺(100μM)
          PEST(P104U/ml S104μg/ml)
          層粘連蛋白(100μg/ml)
          纖維連接蛋白(250μg/ml )
          堿*rhFGF, (10μg/ml)
          包被有多聚鳥氨酸/纖維結合蛋白的培養板(使用或不使用蓋玻片)

    包被液的準備
          多聚-L-賴氨酸,15μg/ml
          把75ml多聚-L-賴氨酸和425ml 1×PBS混合。貯存在4℃。
          纖維結合蛋白,1μg/ml
          把0.5ml纖維結合蛋白和500ml 1×PBS混合。

    包被過程:

    1、加入多聚-L-賴氨酸,至少2-3小時(過夜也行)
          2、吸出多聚-L-賴氨酸
          3、加入纖維結合蛋白,大約1-2小時
          4、吸出纖維結合蛋白,放置30分鐘晾干
          5、貯存在4℃

    24孔板用200μl,6孔板用500μl。震蕩培養板確保溶液能夠覆蓋蓋玻片或培養孔。有時需要劇烈震蕩培養板。





    此文轉載來源:丁香通  

     

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