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    多藥抗藥基因的表達實驗

         多藥抗藥基因的表達實驗是通過反轉錄和PCR的方法來檢測特定基因的過度表達。


    實驗方法原理

          大多MDR細胞膜上出現MDR-1基因及其基因產物P-糖蛋白過度表達。


    實驗材料

          RNA


    試劑、試劑盒

          PBS   氯仿   異丙醇   萘酸   異硫氰酸肽   十二烷基肌酸鈉    構櫞酸鈉   乙酸鈉   二疏基乙醇   乙醇   Taq酶


    儀器、耗材

          離心機   紫外分光光度計   瓊脂糖凝膠電泳   PCR儀


    實驗步驟

    一、細胞總RNA提取
          1.  收集約5×107個細胞,冷PBS洗滌。
          2.  加入400 ul RNA提取液(含6 mol/l 的異硫氰酸肽,0.5%十二烷基肌酸鈉,0.025 mol/l 構櫞酸鈉pH7.0,0.25 mol/l 乙酸鈉,pH4.0,0.5%二疏基乙醇,50%萘酸),混勻。
          3.  加入400 ul 氯仿,混勻,以13 000 r/min 于4℃離心15 min。
          4.  取上清液加入等體積的異丙醇,4℃放置30 min。
          5.  然后以13 000 r/min 離心15 min,吸上清,將RNA成點用75%的乙醇洗滌1次,溶于100 ul 的無菌雙蒸餾水中。
          6.  并用紫外分光光度計檢測RNA純度(A260/A280應為1.8~2.0)后備用。


    二、反轉錄及PCR擴增
          1.  引物
     


          2.  取細胞總RNA10 ul 加入20 ul AMV逆轉錄酶反應體系中,42℃保溫30 min 進行反轉錄,合成cDNA。

          3.  然后置95℃,3 min 終止反轉錄。

          4.  接著在Taq酶的作用下,用mdr-1和β2-MG引物,對cDNA上的目的片段進行PCR

          5.  94℃預變性2 min,然后94℃變性1 min,50℃退火1 min,72℃延伸1 min,擴增35個循環。

          6.  最終在60℃保溫7 min,以保證產物充分延伸。

          7.  取10 ul 擴增產物在3%瓊脂糖凝膠電泳后,紫外燈下照相,與mdr-1 cDNA陽性對照,等位的DNA條帶為陽性,反之為陰性。


    此文轉載來源:丁香通



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