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  • PAT法分析mRNA Poly(A)尾長度實驗

    實驗方法原理

          PAT法 [ PCR poly(A) test ] 可以快速、靈敏地從總 RNA 中分析特異 mRNA,而且可以定量估算 RNA poly(A) 尾長度。這方法中,包括 cDNA 合成的整個操作過程都在一個反應管中完成,不僅操作更簡便,也減少了可能存在的 RNase 污染。尤其是 PAT cDNA 合成后非常穩定,并可重復使用,該方法的易操作性及靈敏度使其可以在任何系統中分析 poly(A) 尾的長度,目前已成功應用于鼠卵母細胞、果蠅卵母細胞和肝胎、線蟲、酵母及培養細胞中 poly(A) 的分析。


    實驗材料

          T4 DNA連接酶   無 RNase H SuperscriptⅡ反轉錄酶   寡聚(dT)錨引物   mRNA特異引物


    試劑、試劑盒

          蒸餾水   Superscript Ⅱ RT緩沖液   DTT   ATP   dNTP   Taq DNA聚合酶   Taq DNA聚合酶緩沖液


    實驗步驟

    一、材料與設備

    1. PAT cDNA 制備

          (1) DEPC 處理蒸餾水。

          (2) 高濃度T4 DNA 連接酶(10 Weiss U/L)。

          (3) 無 RNase H Superscript Ⅱ 反轉錄酶(RT) ( Life Technologies,Gairhersburg,MD,USA ) ( 200 U/μl )。

          (4) 5 X Superscript Ⅱ RT 緩沖液。

          (5) 0.1 mol/L DTT,DEPC 水配制。

          (6) 10 mmol/L ATP,DEPC 水配制。

          (7) 40 mmoI/L dNTP ( 10 mmol/L dATP、10 mmol/L dTTP、10 mmol/L dCTP、10 mmol/L dGTP),DEPO-H2O 配制。

          (8) p[dT]12-18注意寡[dT]12-18必須被磷酸化 ],10 ng/μl。

          (9) 寡聚(dT ) 錨引物(5'-GCG AGC TCC GCG GCC GCG T12)200 ng/μl ( 也可以使用其他 3' 端具有寡聚 dT 延伸(n>10 ) 并且 5' 富含 GC 的寡核背酸作為 PCR 引物),DEPC 水配制,所有上述酶及溶液均保存于 -20℃ 。

    2. PCR 反應

          (1) 40 mmol/L dNTP ( 10 mmol/L dATP、10 mmol/L dTTP、10 mmol/L dCTP、10 mmol/L dGTP),DEPC 水配制。

          (2) 寡聚(dT ) 錨引物 200 ng/μl 水配制。

          (3) mRNA 特異引物,溶于蒸餾水。

          (4) Taq DNA 聚合酶。

          (5) 10X Taq DNA 聚合酶緩沖液。



    二、操作方法

    1. PAT cDNA 制備

          (1) 從組織或細胞中提取總 RNA 溶于 DEPC 水中,取 5 μl 加入無 RNase 的微量離心管中。

          (2) 加入 2 μl (20 ng) p[dT]12-18 至每個 RNA 樣品中,RNA 和 p[dT]12-18 的總體積為 7 μl。

          (3) 加熱到 65℃,變性 5~10 min。

          (4) 立即將反應管置于 42°C 水浴中,注意動作要迅速,以避免 p[dT]12-18 與最未端 poly(A) 尾退火。

          (5) 加入 13 μl 預熱至 42°C 的 下列混合物,用吸頭吹打混勻,置 42℃ 孵育 30 min。對于所有 PAT 反應,預先混合所有相同組分,對于每一個反應,應加入:4 μl 5X Superscript II RT 緩沖液,2 μl 0.1 mol/L DTT,1 μl 40 mmol/L dNTP 混合物,1 μl 10 mmol/L ATP, 4 μl DEPC 處理水,1 μl T4 DNA 連接酶 10 Weiss U/μl。

          (6) 孵育后,反成物仍保溫于 42℃ ,加入 1 μl (200 ng ) 寡聚(dT) 錨引物?;靹?,快速離心,12℃ 孵育 2 h。

          (7) 將反應管置于 42℃ 孵育 2min。

          (8) 加入 1 μl 無 RNase H Superscript II 反轉錄酶,混勻,置于 42°C 孵育 1 h。

          (9) 加熱 20 min,使反轉錄酶和連接酶失活,PAT cDNA 可根據需要進行稀釋。

    2. PCR 反應

          (1) 25~50 μl 標準反應體系包括:1X 緩沖液 [ 50 mmol/L KCl,10 mol/L Tris-HCl ( 25°C 時 pH 9.0 ),0.1% Triton X-100,1.5 mmol/L MgCl2 ],0.2 mmol/L dNTP,0.5 μmol/L 模板特異引物,0.5 μmol/L 寡聚(dT) 錨引物,0.5~1.0 U Taq DMA 聚合酶, 0.5~1.0 μl PAT cDNA 作為模板。

          (2) 擴增 500 bp 長片段建議使用的循環條件:93°C 變性 5 min,93°C 變件 30 s,57~65°C 復性 1 min,72℃ 延伸 1 min,最后 72°C 延伸 7 min。

          (3) 可以取一小部分擴增產物,利用限制性內切核酸酶完全消化分析 3' 末端。

          (4) 用凝膠電泳分析擴增產物。

     

          此文轉載:丁香通



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