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  • TRIzol RNA提取方法
    實驗方法原理
    1. Trizol是一種新型總RNA抽提試劑,采用變性劑即內含異硫氰酸胍酚和β-巰基乙醇等變性物質,能迅速破碎細胞,抑制細胞釋放出的核酸酶。

    2. 異硫氰酸胍屬于解偶劑,是一類強力的蛋白質變性劑,可溶解蛋白質,并使蛋白質二級結構消失,細胞結構降解,核蛋白迅速與核酸分離。β-巰基乙醇主要破壞RNase蛋白質中的二硫鍵。

    3.  細胞裂解后,細胞釋放出蛋白質、DNA、RNA等物質,再根據它們在不同的PH值和不同極性溶劑的溶解度不同而使得分開。

    實驗材料  細胞樣品
    試劑、試劑盒 TRIzol試劑氯仿異丙醇75%乙醇DEPC H2O
    儀器、耗材 離心管離心機 EP管 勻漿器 移液管 冰袋 漩渦振蕩器
    實驗步驟
    1. 樣品處理:

    (1) 培養細胞: 收獲細胞1-5×107,移入1.5ml離心管中,加入1ml Trizol,混勻,室溫靜置5min。

    (2) 組織:取50-100mg組織(新鮮或-70℃及液氮中保存的組織均可)置1.5ml離心管中,加入1ml Trizol充分勻漿,室溫靜置5min。

    2. 加入0.2ml氯仿,振蕩15s,靜置2min。

    3. 4℃離心,12000g×15min,取上清。

    4. 加入0.5ml異丙醇,將管中液體輕輕混勻,室溫靜置10min。

    5. 4℃離心,12000g×10min,棄上清。

    6. 加入1ml 75%乙醇,輕輕洗滌沉淀。4℃,7500g×5min,棄上清。

    7. 晾干,加入適量的DEPC H2O溶解(65℃促溶10-15min)
    收起 
    注意事項
    1.樣品量和Trizol的加入量一定要按步驟(1)的比例,不能隨意增加樣品量或減少Trizol量,否則會使內源性RNase的抑制不完全,導致RNA降解。

    2.實驗過程必須嚴格防止RNsae的污染。
    其他
    一、RNA的定量計算

    1.  RNA定量方法與DNA定量相似。RNA在260nm波長處有最大的吸收峰。因此,可以用260nm波長分光測定RNA濃度,OD值為1相當于大約40μg/ml的單鏈RNA。如用1cm光徑,用 ddH2O稀釋DNA樣品n倍并以ddH2O為空白對照,根據此時讀出的OD260值即可計算出樣品稀釋前的濃度:

    RNA(mg/ml)=40×OD260讀數×稀釋倍數(n)/1000
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