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  • RNA干擾(轉錄后基因沉默)實驗
    實驗方法原理 1. 病毒基因、人工轉入基因、轉座子等外源性基因隨機整合到宿主細胞基因組內,并利用宿主細胞進行轉錄時,常產生一些dsRNA。宿主細胞對這些dsRNA迅即產生反應。其胞質中的核酸內切酶Dicer將dsRNA切割成多個具有特定長度和結構的小片段RNA(大約21——23 bp),即siRNA。siRNA在細胞內RNA解旋酶的作用下解鏈成正義鏈和反義鏈,繼之由反義siRNA再與體內一些酶(包括內切酶、外切酶、解旋酶等)結合形成RNA誘導的沉默復合物(RNA-induced silencing complex,RISC)。RISC與外源性基因表達的mRNA的同源區進行特異性結合,RISC具有核酸酶的功能,在結合部位切割mRNA,切割位點即是與siRNA中反義鏈互補結合的兩端。被切割后的斷裂mRNA隨即降解,從而誘發宿主細胞針對這些mRNA的降解反應。siRNA不僅能引導RISC切割同源單鏈mRNA,而且可作為引物與靶RNA結合并在RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase,RdRP)作用下合成更多新的dsRNA,新合成的dsRNA再由Dicer切割產生大量的次級siRNA,從而使RNAi的作用進一步放大,最終將靶mRNA完全降解。

    2. RNAi具有的特征

    ①RNAi是轉錄后水平的基因沉默機制;

    ②RNAi具有很高的特異性,只降解與之序列相應的單個內源基因的mRNA;

    ③RNAi抑制基因表達具有很高的效率,表型可以達到缺失突變體表型的程度,而且相對很少量的dsRNA分子(數量遠遠少于內源mRNA的數量)就能完全抑制相應基因的表達,是以催化放大的方式進行的;

    ④RNAi抑制基因表達的效應可以穿過細胞界限,在不同細胞間長距離傳遞和維持信號甚至傳播至整個有機體以及可遺傳等特點;

    ⑤dsRNA不得短于21個堿基,并且長鏈dsRNA也在細胞內被Dicer酶切割為21 bp左右的siRNA,并由siRNA來介導mRNA切割。而且大于30 bp的dsRNA不能在哺乳動物中誘導特異的RNA干擾,而是細胞非特異性和全面的基因表達受抑和凋亡;

    ⑥ATP依賴性:在去除ATP的樣品中RNA干擾現象降低或消失顯示RNA干擾是一個ATP依賴的過程??赡苁荄icer和RISC的酶切反應必須由ATP提供能量。

    3. 也有研究證明含有啟動子區的dsRNA在植物體內同樣被切割成21-23nt長的片段,這種dsRNA可使內源相應的DNA序列甲基化,從而使啟動子失去功能,使其下游基因沉默。
    實驗材料 mRNA
    試劑、試劑盒  shRNA  試劑盒siRNA  試劑盒Dicer  酶載體病毒
    儀器、耗材    培養皿RT-PCR儀、Real-time PCR儀
    注意事項
    1. 可以通過標記siRNA來優化實驗:熒光標記的siRNA能用來分析siRNA穩定性和轉染效率。標記的siRNA還可用作siRNA胞內定位及雙標記實驗(配合標記抗體)來追蹤轉染過程中導入了siRNA的細胞,將轉染與靶蛋白表達的下調結合起來。

    2. siRNA的設計方法多樣,需要根據自己的實驗情況認真選擇,且陽性對照和陰性對照組需要齊全。
    其他
    提高siRNA和表達載體轉染效率的方法:

    1. siRNA必須純化:在轉染前要確認siRNA的大小和純度,為得到高純度的siRNA,推薦用玻璃纖維結合,洗脫或通過l5%——20%丙烯酰胺膠除去反應中多余的核苷酸、小的寡核苷酸、蛋白質和鹽離子。尤其是化學合成的RNA通常需要PAGE膠純化。

    2. 避免RNA酶污染:即使微量的RNA酶也會導致實驗失敗。由于實驗環境中RNA酶普遍存在,因此保證實驗每個步驟不受RNA酶污染非常重要。

    3. 健康的細胞培養物和嚴格的操作:通常健康的細胞轉染效率較高。此外,較低的傳代數能確保每次實驗所用細胞的穩定性。為了優化實驗,推薦用50代以下的轉染細胞,否則細胞轉染效率會隨時間明顯下降。

    4. 通過合適的陽性對照優化轉染和檢測條件:將不同濃度陽性對照的siRNA轉入靶細胞,轉染48h后統計對照蛋白質或mRNA相對于未轉染細胞的降低水平,過多的siRNA將導致細胞毒性以至死亡。
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