總RNA提取實驗
發布人：管理員 瀏覽次數： 發布時間：2018-12-18
實驗方法原理
一些公司推出的總RNA 提取試劑盒，可以用來制備高質量的可用于建庫的RNA 。該總RNA 純化系統采用兩種著名的RNA 酶抑制劑，異硫氰酸弧(GTC)和β-巰基乙醇，加上整個操作都在冰浴下進行，這樣就能顯著降低RNA 的降解速率。GTC和N-十二烷基肌氨酸鈉的聯合使用，將促使核蛋白復合體的解離，使RNA 與蛋白質分離，并將RNA 釋放到溶液中。而進一步從復合體中純化RNA ，則根據Chomc zynski和Sacchi的一步快速抽提法進行，采用酸性酚-氯仿混合液抽提。低pH值的酚將使RNA 進入水相，這樣使其與仍留在有機相中的蛋白質和DNA分離。水相中的RNA 可用異丙醇沉淀濃縮。進一步將上述RNA 沉淀復溶于GTC溶液中，接著用異丙醇進行二次沉淀，隨后用乙醇洗滌沉淀，即可去除所有殘留的蛋白質和無機鹽，而RNA 中如含無機鹽，則有可能對以后操作中的一些酶促反應產生抑制。
實驗材料： 微生物 動物細胞 植物組織
試劑、試劑盒 ： RNA 提取試劑盒 焦碳酸二乙酯 乙醇
儀器、耗材： 恒溫水 浴冷凍高速離心機 紫外分光光度計 取液器 電泳儀 電泳槽
實驗步驟
一、細胞或組織破碎
1. 微生物材料
（1）發酵3~4天（或對數生長期）的菌體，離心收集菌絲體（動植物材料無需此步處理）。
（2）用經DEPC處理的水洗菌絲體2~3次，并盡量除去殘存的水。
（3）加液氮充分研磨，使其成為粉末，以釋放RNA。
（4）研磨后的樣品轉移至12 ml 變性液的容器中勻漿。
2. 動植物細胞培養材料 （適用的樣品量為細胞：108）
（1）細胞或組織培養：按常規方法進行。
（2）深層懸浮培養細胞的破碎。
①細胞收集：含一定濃度的細胞培養液置于無菌離心管中，4℃，3 000 g 離心5分鐘。
②細胞洗滌：上步沉淀用25 ml 滅菌后冰凍的1×PBS緩沖液洗滌，然后4℃，3 000 g 離心5分鐘。
③細胞破碎：在沉淀細胞中加入15 ml 預冷的變性液，用無菌處理過的勻漿器勻漿。
3. 表面培養細胞的破碎
（1）確定培養瓶數量，使選定的各培養瓶細胞累加后總量達108。
（2）細胞收集：將培養液倒掉，用預冷的無菌PBS緩沖液洗滌一次，在培養瓶中加入8 ml 預冷變性液。
（3）轉動培養瓶，使細胞溶解，此時可見粘度加大。
（4）用無菌吸管將第一個培養瓶中的液體吸入第二個培養瓶，旋轉，溶解細胞，再吸入第三個培養瓶，以此類推。
（5）直到將所選定的培養瓶全部洗滌一次，然后從第一個培養瓶開始再加入4毫升上述變性液，將所有培養瓶洗一次。
（6）將上述12 ml 含細胞的變性液轉移至一50 ml 無菌離心管中，勻漿破碎細胞。
4. 植物組織破碎 （適用的樣品量為0.05 g 組織）
（1）將600 ul 變性液置于1.5 ml 離心管中，將此離心管放于冰浴中5分鐘。
（2）將0.05 g 新鮮組織用液氮冰凍。
（3）在液氮下，研磨組織塊。
（4）待液氮揮發后，將上述分散的組織轉移至無菌離心管中。
5. 動物組織破碎 （適用的樣品量為1 g 組織）
（1）將12 ml 變性液置于50 ml 離心管中，將此離心管放于冰浴中5分鐘。
（2）在上述管中加入1 g 新鮮或冰凍動物組織，勻漿粉碎。
二、RNA 的抽提
1. 在經變性液勻漿的細胞或組織600 ul+60 ul pH4.0的2 M 乙酸鈉徹底混勻，可用漩渦振蕩器。
2. 600 ul 酚\氯仿\異戊醇（25\24\1），徹底混勻或漩渦振蕩器振蕩10秒。
3. 冰裕中10~15分鐘，離心，4℃，10 000 g，20分鐘。
4. 上層水相吸至無菌離心管中加等體積的異丙醇，-70℃，30分鐘沉淀RNA。
5. 離心4℃，10 000 g，20分鐘。
6. 沉淀RNA ，冷凍干燥15分鐘 ， RNA 沉淀重新溶于300 ul 變性液中，可振蕩（有時為了幫助溶解，可在65℃加熱，但時間應極短）。
7. 60 ul pH4.0的2 M 乙酸鈉徹底混勻，可用漩渦振蕩器。
8. 600 ul 酚\氯仿\異戊醇（25\24\1），徹底混勻或漩渦振蕩器振蕩10秒。
9. 冰裕中10~15分鐘，離心，4℃，10 000 g，20分鐘。
10. 上層水相吸至無菌離心管中。
11. 等體積異丙醇二次沉淀（-70℃，30分鐘），75%乙醇洗沉淀，沉淀冷凍干燥。
12. 復溶于去RNA 酶的水中（對于準備長期保存的RNA 可加入pH 5.0的乙酸鈉至終濃度為0.25 M，再加入2.5體積的乙醇，-70℃保存。）。
注意事項
1. 研磨組織塊用于RNA 提取的樣品，必須是新鮮的細胞或組織，如采樣后，不能立即用于提取則樣品應用液氮速凍并貯于-70℃的冰箱中保存。
2. 變性液及相應的離心管需預冷。
其他
1. 變性液組成
25 g異硫氰酸胍溶于33 ml CSB(42 mM pH4.0乙酸鈉、0.83%十二烷基肌氨酸鈉、0.2 mM β-巰基乙醇)，65℃溶解，過濾滅菌，4℃預冷。
2. 酸性酚配制
55℃時，500 g酚溶入500 ml 50 mM，pH4.0乙酸鈉，混勻，靜止分層后，去上清，再反復加500 ml 50 mM，pH4.0乙酸鈉，直到pH<4.1。
一些公司推出的總RNA 提取試劑盒，可以用來制備高質量的可用于建庫的RNA 。該總RNA 純化系統采用兩種著名的RNA 酶抑制劑，異硫氰酸弧(GTC)和β-巰基乙醇，加上整個操作都在冰浴下進行，這樣就能顯著降低RNA 的降解速率。GTC和N-十二烷基肌氨酸鈉的聯合使用，將促使核蛋白復合體的解離，使RNA 與蛋白質分離，并將RNA 釋放到溶液中。而進一步從復合體中純化RNA ，則根據Chomc zynski和Sacchi的一步快速抽提法進行，采用酸性酚-氯仿混合液抽提。低pH值的酚將使RNA 進入水相，這樣使其與仍留在有機相中的蛋白質和DNA分離。水相中的RNA 可用異丙醇沉淀濃縮。進一步將上述RNA 沉淀復溶于GTC溶液中，接著用異丙醇進行二次沉淀，隨后用乙醇洗滌沉淀，即可去除所有殘留的蛋白質和無機鹽，而RNA 中如含無機鹽，則有可能對以后操作中的一些酶促反應產生抑制。
實驗材料： 微生物 動物細胞 植物組織
試劑、試劑盒 ： RNA 提取試劑盒 焦碳酸二乙酯 乙醇
儀器、耗材： 恒溫水 浴冷凍高速離心機 紫外分光光度計 取液器 電泳儀 電泳槽
實驗步驟
一、細胞或組織破碎
1. 微生物材料
（1）發酵3~4天（或對數生長期）的菌體，離心收集菌絲體（動植物材料無需此步處理）。
（2）用經DEPC處理的水洗菌絲體2~3次，并盡量除去殘存的水。
（3）加液氮充分研磨，使其成為粉末，以釋放RNA。
（4）研磨后的樣品轉移至12 ml 變性液的容器中勻漿。
2. 動植物細胞培養材料 （適用的樣品量為細胞：108）
（1）細胞或組織培養：按常規方法進行。
（2）深層懸浮培養細胞的破碎。
①細胞收集：含一定濃度的細胞培養液置于無菌離心管中，4℃，3 000 g 離心5分鐘。
②細胞洗滌：上步沉淀用25 ml 滅菌后冰凍的1×PBS緩沖液洗滌，然后4℃，3 000 g 離心5分鐘。
③細胞破碎：在沉淀細胞中加入15 ml 預冷的變性液，用無菌處理過的勻漿器勻漿。
3. 表面培養細胞的破碎
（1）確定培養瓶數量，使選定的各培養瓶細胞累加后總量達108。
（2）細胞收集：將培養液倒掉，用預冷的無菌PBS緩沖液洗滌一次，在培養瓶中加入8 ml 預冷變性液。
（3）轉動培養瓶，使細胞溶解，此時可見粘度加大。
（4）用無菌吸管將第一個培養瓶中的液體吸入第二個培養瓶，旋轉，溶解細胞，再吸入第三個培養瓶，以此類推。
（5）直到將所選定的培養瓶全部洗滌一次，然后從第一個培養瓶開始再加入4毫升上述變性液，將所有培養瓶洗一次。
（6）將上述12 ml 含細胞的變性液轉移至一50 ml 無菌離心管中，勻漿破碎細胞。
4. 植物組織破碎 （適用的樣品量為0.05 g 組織）
（1）將600 ul 變性液置于1.5 ml 離心管中，將此離心管放于冰浴中5分鐘。
（2）將0.05 g 新鮮組織用液氮冰凍。
（3）在液氮下，研磨組織塊。
（4）待液氮揮發后，將上述分散的組織轉移至無菌離心管中。
5. 動物組織破碎 （適用的樣品量為1 g 組織）
（1）將12 ml 變性液置于50 ml 離心管中，將此離心管放于冰浴中5分鐘。
（2）在上述管中加入1 g 新鮮或冰凍動物組織，勻漿粉碎。
二、RNA 的抽提
1. 在經變性液勻漿的細胞或組織600 ul+60 ul pH4.0的2 M 乙酸鈉徹底混勻，可用漩渦振蕩器。
2. 600 ul 酚\氯仿\異戊醇（25\24\1），徹底混勻或漩渦振蕩器振蕩10秒。
3. 冰裕中10~15分鐘，離心，4℃，10 000 g，20分鐘。
4. 上層水相吸至無菌離心管中加等體積的異丙醇，-70℃，30分鐘沉淀RNA。
5. 離心4℃，10 000 g，20分鐘。
6. 沉淀RNA ，冷凍干燥15分鐘 ， RNA 沉淀重新溶于300 ul 變性液中，可振蕩（有時為了幫助溶解，可在65℃加熱，但時間應極短）。
7. 60 ul pH4.0的2 M 乙酸鈉徹底混勻，可用漩渦振蕩器。
8. 600 ul 酚\氯仿\異戊醇（25\24\1），徹底混勻或漩渦振蕩器振蕩10秒。
9. 冰裕中10~15分鐘，離心，4℃，10 000 g，20分鐘。
10. 上層水相吸至無菌離心管中。
11. 等體積異丙醇二次沉淀（-70℃，30分鐘），75%乙醇洗沉淀，沉淀冷凍干燥。
12. 復溶于去RNA 酶的水中（對于準備長期保存的RNA 可加入pH 5.0的乙酸鈉至終濃度為0.25 M，再加入2.5體積的乙醇，-70℃保存。）。
注意事項
1. 研磨組織塊用于RNA 提取的樣品，必須是新鮮的細胞或組織，如采樣后，不能立即用于提取則樣品應用液氮速凍并貯于-70℃的冰箱中保存。
2. 變性液及相應的離心管需預冷。
其他
1. 變性液組成
25 g異硫氰酸胍溶于33 ml CSB(42 mM pH4.0乙酸鈉、0.83%十二烷基肌氨酸鈉、0.2 mM β-巰基乙醇)，65℃溶解，過濾滅菌，4℃預冷。
2. 酸性酚配制
55℃時，500 g酚溶入500 ml 50 mM，pH4.0乙酸鈉，混勻，靜止分層后，去上清，再反復加500 ml 50 mM，pH4.0乙酸鈉，直到pH<4.1。
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