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  • 土壤DNA 純化難點——腐殖質

    土壤,是由一層層厚度各異的礦物質成分所組成大自然主體。土壤和母質層的區別表現在于形態、物理特性、化學特性以及礦物學特性等方面。由于地殼、水蒸氣、大氣和生物圈的相互作用,土層有別于母質層。它是礦物和有機物的混合組成部分,存在著固體,氣體和液體狀態。疏松的土壤微粒組合起來,形成充滿間隙的土壤的形式。這些孔隙中含有溶解溶液(液體)和空氣(氣體),因此,土壤通常被視為有多種狀態 。

       

    提取土壤中微生物、動植物遺體等的DNA是在分子水平上研究生態、環境保護與修復及菌種篩選等的基礎。土壤的成分包括礦物質、粘土等無機物、植物及植物的遺體、腐殖物質等土壤有機物以及在土壤中存在的微生物,其中絕大部分的微生物都是無法直接培養進行繁殖和研究,從土壤樣品中提取DNA是研究土壤微生物最為有效的方法。

       

    在整個提取的過程中,腐殖質是最大的干擾因素。腐殖質是已死的生物體在土壤中經微生物分解而形成的有機物質,含有植物生長發育所需要的一些元素,能改善土壤,增加肥力。主要方法是幫助增加可以讓空氣和水進入的空隙,也同樣產生植物必須的氮,硫,鉀和磷。動植物殘體在微生物作用下形成簡單化合物的同時又重新合成復雜的高分子化合物。但是由于腐殖物質的性質與DNA十分相似,從土壤中提取的DNA的同時也會將將腐殖質等物質一起純化,因而采用一般的DNA提取方法很難除去腐殖物質等抑制因子,再加上這些腐殖物質會抑制聚合酶鏈式反應(PCR)及限制性酶切等,因此,徹底去除腐殖物質等抑制因子是整個操作過程中的重點,也是難點。

      

     目前從土壤樣品中提取微生物DNA的方法主要有直接法和間接法。直接法是指將土壤樣品放在裂解液中,經過有效的破壁方法使微生物的DNA全部釋放到裂解液中,然后再進行分離提取的方法。間接法是指將土壤放在一種的緩沖液中,如Buffer PBS等,把微生物從土壤中分離出來,然后再進行DNA的提取。間接法可大大降低土壤中腐殖酸,重金屬鹽對DNA提取帶來的影響,但是這種方法會丟失許多微生物,得到的DNA并非土壤樣品中的全基因組(宏基因組),間接法使用的已經很少了。

       

    目前市面上對于去除腐殖質工藝做的最好的試劑盒,就是MPbio公司的土壤DNA提取試劑盒,該試劑盒能夠有效去除土壤樣本中的腐殖質,極大提高目標DNA的提取濃度,很多土壤相關工作人員都選用該試劑盒。不過優秀的產品也會有短板,MP試劑盒在有效去除腐殖質的過程中難免會造成目標DNA的損失,操作過程略顯繁瑣,同時作為一個進口的產品,價格因素可以說是該產品最大的短板。   

       杭州新景生物試劑開發有限公司作為新手福音,業界良心,經過一系列的研究,終于開發了一種高效的去腐殖酸緩沖液,最大限度的去除土壤樣本中的腐殖質,保留目標DNA,結合硅膠柱純化的技術,得到高純度的土壤微生物DNA。
       

    我們的操作方法和一般的提取土壤DNA試劑盒有所不同,先要進行樣本的前處理,將土壤樣本經過去腐緩沖液洗滌,然后進行DNA提取得到高純度且不含腐殖酸的土壤DNA。我們可以將多達500 mg的土壤樣本放入含有陶瓷顆粒的2.0 ml試管中,首先使用去腐緩沖液洗滌,離心去上清后使用高效裂解液裂解所有土壤生物,包括之前難以裂解的種類,如真細菌孢子和芽孢、革蘭氏陽性菌、酵母、藻類、線蟲和真菌。離心后取上清與結合液結合,過硅膠柱進行DNA純化即可得到高純度DNA。

       

    實驗室將MP的試劑盒和公司的試劑盒做了一個平行實驗,驗證了新產品的結果。

       

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    此文章轉載來源:百度文庫


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