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  • 微生物的分離純化及稀釋平板菌落計數
    實驗方法原理
    一、自然條件下,微生物常以群落狀態存在,這種群落往往是不同種類微生物的混合體。為了研究某種微生物的特性或者要大量培養和使用某種微生物,必須從這些混雜的微生物群落中獲得純培養,這種獲得純培養的方法稱為微生物的分離與純化。

    二、稀釋平板測數是根據微生物在高度稀釋條件下固體培養基上所形成的單個菌落是由一個單細胞繁殖而成這一培養特征設計的計數方法,即一個菌落代表一個單細胞。計數時,(1)首先將待測樣品制成均勻的繁殖稀釋液,盡量使樣品中的微生物細胞分散開,使其成單個細胞存在,否則一個菌落就不只是代表一個細胞;(2)再取一定稀釋度、一定量的稀釋液接種到平板中,使其均勻分布于平板中的培養基內;(3)經培養后,由單個細胞生長繁殖形成菌落,統計菌落數目,即可計算出樣品中的含菌數。此記數方法所計算的菌數是培養基上長出來的菌落數,故又稱活菌計數。
    實驗材料 蘇云金芽胞桿菌菌劑
    試劑、試劑盒 牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基高氏一號瓊脂培養基馬丁氏瓊脂培養基
    儀器、耗材 天平稱樣瓶試管架酒精燈接種環
    實驗步驟
    一、樣品稀釋液的制備

    1. 準確稱取待測樣品10g,放入裝有90mL無菌水并放有小玻璃珠的250mL三角瓶中,用手或置搖床上振蕩20min,使微生物細胞分散,靜置20~30s,即成10-1稀釋液;再用1mL無菌吸管,吸取10-1稀釋液1mL,移入裝有9mL無菌水的試管中,吹吸3次,讓菌液混合均勻,即成10-2稀釋液;再換一支無菌吸管,吸取10-2稀釋液1mL,移入裝有9mL無菌水的試管中,也吹吸3次,即成10-3稀釋液;以此類推,連續稀釋,制成10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9等一系列稀釋菌液。

    2. 用稀釋平板計數時,待測菌稀釋度的選擇應根據樣品確定。樣品中所含待測菌的數量多時,稀釋度應高,反之則低。通常測定細菌菌劑含菌數時,采用10-7、10-8、10-9稀釋度,測定土壤細菌數量時,采用10-4、10-5、10-6稀釋度,測定放線菌數量時,采用10-3、10-4、10-5稀釋度,測定真菌數量時,采用10-2、10-3、10-4稀釋度。    
            
    二、平板接種培養

    1.混合平板培養法:將無菌平板編上10-7、10-8、10-9號碼,每一號碼設置三個重復,用無菌吸管按無菌操作要求吸取1×10-9稀釋液各1mL放入編號10-9的3個平板中,同法吸取10-8稀釋液各1mL放入編號1×10-8的3個平板中,再吸取1×10-7稀釋液各1mL放入編號1×10-7的3個平板中,由低濃度向高濃度時,吸管可不必更換。然后在9個平板中分別倒入已熔化并冷卻至45~50℃的細菌培養基,輕輕轉動平板,使菌液與培養基混合均勻,冷凝后倒置,在30℃下培養。至菌落長出后即可計數。

    2. 涂抹平板計數法:涂抹平板計數法與混合法基本相同,所不同的是先將培養基熔化后趁熱倒入無菌平板中,待凝固后編號,然后用無菌吸管吸取0.1mL菌液對號接種在不同稀釋度編號的瓊脂平板上,每個編號設三個重復。再用無菌刮鏟將菌液在平板上涂抹均勻,每個稀釋度用一個滅菌刮鏟,更換稀釋度時需將刮鏟灼燒滅菌。在由低濃度向高濃度涂抹時,也可以不更換刮鏟。將涂抹好的平板平放于桌上20~30min,使菌液滲透入培養基內,然后將平板倒轉,保溫培養,至菌落長出后即可計數。

    三、分離方法

    1.混菌法:按“稀釋平板測數法”中的“混合平板培養法”進行,使用的稀釋度為10-4、10-4、10-6三個,各做3個重復。

    2. 涂抹法:按“稀釋平板測數法”中的“涂抹平板測數法”進行,使用的稀釋度為10-3、10-4、10-5三個,各做3個重復。

    3.劃線法:用滅菌接種環沾取10-1稀釋液1環于已凝固的平板上進行劃線(圖示)。劃線可按以下兩種方式進行,一種為交叉劃線法,是在平板的一邊做第一次“Z”字形劃線。轉動培養皿70°角,將接種環在火上燒過并冷卻后,通過第一次劃線部分,做第二次“Z”字形劃線。同法進行第三次、第四次劃線。另一種為邊疆劃線法,是從平板邊緣的一點開始,連續作緊密的波浪式劃線,直至平板中央。轉動培養皿180°,再從平板另一邊(不燒接種環)同樣劃線至平板中央。劃線法實質上屬于一種“由點到線”的稀釋法,較適用于含菌比較單一的材料的純化,對于土壤這類微生物高度混雜的樣品則較少使用。

    四、培養  

    將上述接種過土壤懸液的平板倒置,于28~30℃培養,至長出菌落為止(24~36h)。                            

    五、挑菌純化

    在平板上選擇分離較好的有代表性的單菌落接種斜面,同時作涂片檢查,若發現不純,應挑取此菌落做進一步劃線分離,或制成菌懸液再做稀釋分離,直至獲得純培養體。                                                          

    六、計數

    選取混菌法和涂抹法中每皿菌落數30~300的平板,分別按“稀釋平板測數法”中的“混合平板測數法”和“涂抹平板測數法”中的公式計數。這樣求得的是每克原始土樣中的活菌數,若要折算為每克干土的含菌數,還應將此數值除以干土在土樣中所占的質量分數(烘干土的質量/原土樣的質量)。
     
    注意事項
    1. 全過程要在無菌條件下進行。

    2. 接種環使用前在酒精燈上灼燒至紅熱。

    3. 蘸取少量菌液,先在培養皿上劃一條,不要轉動接種環。

    4. 滅菌后,培養基冷卻到 55℃后應及時進行倒平板操作。如果不能及時操作,需要將培 養基放到 55℃左右的電熱箱中保溫,以防止瓊脂凝固。

    5. 實驗后,所有用過的培養基,培養液等都需要統一進行高壓蒸汽滅菌后再丟棄醫療垃圾處,防止造成環境污染。

    其他
    1. 一般來說以平板上的菌落數介于30-300個的為準,用菌落數乘以稀釋度再根據你涂平板的菌液量來計算CFU,如果有兩個稀釋度的菌落數都是介于30-300之間,則分別計算不同稀釋度的菌落數,然后再平均。同一稀釋度的三個平板如果菌落數都差不多,則分別計算CFU再平均,如果有一個和其他兩個差異很大,則建議取那兩個差異不大的平均或者再重復涂平板一次。

    2. 如果要計算總菌數,則最好用計數板,一般的血細胞計數板由于太厚,不能用油鏡,只能用于酵母菌計數,細菌的話要用細菌計數板。
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