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  • 抗生素檢定用芽孢懸液的制備及注意事項
    管碟法是國內外常用的抗生素微生物檢定法,利用管碟法測定抗生素效價,具有準確、直觀、重復性好等優點,因而被廣泛采用。但是整個試驗過程中影響結果的因素很多,任何一個環節操作不當或者忽略就會造成很大誤差,導致整組試驗失敗。其中,芽孢懸液的制備就有很多需要注意的地方。

    在用管碟法檢定抗生素時,需要將菌懸液與培養基混合均勻、覆蓋在底層培養基上,以形成抑菌圈。其中,對于菌懸液的制備要求為:

    將所用菌的斜面培養物用 1~2 ml 滅菌水洗下,形成菌懸液;將菌懸液在營養瓊脂平皿上均勻涂布,置于 35~37℃ 條件下培養 7 天;涂片、染色,鏡檢芽孢率 ≥ 85% 時,用 10 ml 滅菌水將芽孢和菌體的混合物洗下,制成懸液;65℃ 水浴加熱 30 min,殺死菌體,形成有活性的芽孢懸液;冷卻、冰箱中保存備用。

    根據實際操作中的經驗,對這一環節需要注意的事項總結如下:

    1 應該嚴格按照標準操作,將涂好的平皿連續培養 7 天再洗脫芽孢,這樣也有助于芽孢懸液的均一性,避免由于操作標準不一造成的試驗結果的偏差。有文章報道,將平板培養至 2、3、4、5、6 天與培養至第七天,制成的懸液在抗生素效價測定中無差異;但本人在實際試驗中發現,培養 3 天的短小芽孢菌,鏡檢時芽孢率<80%, 并且平皿一旦從培養箱中拿出來,室溫放置至第 10 天,芽孢率也不會再發生明顯變化,這顯然不符合《中國獸藥典》規定的芽孢率 ≥ 85% 的要求。

    2 試驗菌的菌齡對抑菌圈有一定影響。故檢定時應保持菌種及菌液的新鮮。一般菌種一月轉種一次,冰箱冷藏保存。對易變異的菌株,如藤黃微球菌等在制備菌懸液前進行單菌分離;其他菌株可半年分離一次。

    3 試驗菌傳代最好不超過 5 次,以防止菌種老化變異。芽孢桿菌培養物用滅菌水洗下后,應在 65℃ 加熱 30 分鐘,使菌體的菌齡一致(有資料顯示可 70~75℃ 水浴 30 min 殺死菌體)。

    4 加入菌懸液的體積,一般不少于 0.3 ml,并且不大于上層培養基體積的 1%(有資料說不大于 2%)。如果加入菌懸液的體積過小,則在同次實驗中,不同次加入菌懸液的體積相差較大, 造成實驗誤差;如果加入菌懸液的體積過大,則會使上層培養基變稀,并且因菌懸液的溫度較低,加至培養基中可能造成培養基結塊,影響測定結果。對于加入菌懸液體積的控制,可通過調節菌懸液的濃度來實現。

    下面為在海博生物技術公司生產的抗生素檢定Ⅳ號瓊脂上,莫能菌素對短小芽孢菌的抑菌效果:



    圖 a 連續培養 7 天的短小芽孢菌



    圖 b 莫能菌素對短小芽孢菌的抑菌效果

    從照片可以看出,菌懸液中芽孢率符合要求(≥ 85%),抑菌圈透明、邊緣清晰且直徑均勻,符合標準規定的 18~22 mm,效果非常好!

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