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  • PCR法檢測支原體

    實驗方法原理

    PCR法的基本原理是酶促DNA合成反應,即在DNA模板、引物和脫氧核糖核酸存在下,經DNA聚合酶的作用,使DNA鏈擴增延伸。

    實驗材料 細胞樣品
    試劑、試劑盒 : dNTP  TapDNA聚合酶  瓊脂糖  礦物油  支原體檢測試劑盒
    儀器、耗材 :超凈工作臺  PCR儀  電泳儀  凝膠成像分析系統  臺式離心機  旋渦混懸器
    實驗步驟
    1. 樣品的收集:待測細胞用無雙抗培養基培養7d,用無菌容器取上清液500μl,4℃保存待測。
    2. 模板的制作:在無菌的條件下,取細胞培養上清液100μl于一無菌的0.5ml塑料離心管內,蓋好蓋子,95℃水浴加熱5min。
    3. 打開蓋子,向管內加StrataClean樹脂10μl,蓋好蓋子,旋渦混懸器混合,離心5——10s,吸取上清至一新的塑料離心管中,模板制作完畢,4℃保存。
    4. PCR反應:
    反應體系最適條件為:10mmol/L Tris-HCl(pH 8.38),50mmol/L KCl,1.5——2.5mmol/LMgCl2,200 μmol/L dNTP,2U Taq DNA聚合酶;總反應體系為50μl,反應用去離子水均需用12000μJ/cm2紫外燈照射。
    (1)在0.5ml塑料離心管中加入35.2μl去離子水及5μl 10×Taq反應緩沖液。
    (2)依次加入下列成分:0.4μl dNTP(25mmol/L);0.4μl Taq酶(5U/μl);2μl引物。
    (3)加2μl去離子水,總體積45μl。
    (4)加5μl已制成的模板到反應體系中。
    (5)陽性對照、內對照各5μl加入到各自的反應體系中。
    (6)取1支含有以上反應體系的離心管,加入5μl去離子水作為陰性對照管。
    (7)在反應體系中加入100μl礦物油。
    (8)PCR程序
    程序1:    94℃ 2min、50℃ 2min、72℃ 2min,1個循環;
    程序2:    94℃ 1min、50℃ 1min、72℃ 2min,共40個循環。
    5. 瓊脂糖凝膠電泳:PCR反應結束后,進行瓊脂糖凝膠電泳,瓊脂糖凝膠濃度2%。電泳結束后,凝膠成像分析結果。
    6. 實驗結果及分析:
    該方法為檢測支原體的定性方法,在電泳泳道上,Marker(DNA分子質量標準參照物)、陽性對照、內對照均會出現不同的電泳條帶。當被檢樣品泳道出現明亮條帶,且位置在陽性對照和陰性對照條帶位置之間,即可認為該樣品被支原體污染。有時還會發現一條泳道出現多條,可能是該樣品感染2種以上支原體所致。
    注意事項
    1. PCR反應的前期操作應在無菌環境中進行。
    2. 檢測前,待測細胞要用無雙抗培養基培養7d。
    其他
                                                                                                                                                                                                                                                                            來源《細胞生物學實驗技術》
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