<nav id="r8owu"></nav>
  • <wbr id="r8owu"><source id="r8owu"></source></wbr>

    <nav id="r8owu"><listing id="r8owu"><small id="r8owu"></small></listing></nav>
  • 當前位置 :主頁 > 技術交流 > 細胞學技術 >
    MTT實驗前注意事項及貼壁細胞/懸浮細胞實驗大匯總

    實驗前應明確的問題



    1. 選擇適當的細胞接種濃度。一般情況下,96孔培養板的一內貼壁細胞長滿時約有105個細胞。但由于不同細胞貼壁后面積差異很大,因此,在進行mtt 試驗前,要進行預實驗檢測其貼壁率、倍增時間以及不同接種細胞數條件下的生長曲線,確定試驗中每孔的接種細胞數和培養時間,以保證培養終止致細胞過滿。這樣,才能保證MTT結晶形成酌量與細胞數呈的線性關系。否則細胞數太多敏感性降低,太少觀察不到差異。


    2. 藥物濃度的設定。一定要多看文獻,參考別人的結果再定個比較大的范圍先初篩。根據自己初篩的結果縮小濃度和時間范圍再細篩。切記!否則,可能你用的時間和濃度根本不是藥物的有效濃度和時間。


    3. 時間點的設定。在不同時間點的測定OD值,輸入excel表,最后得到不同時間點的抑制率變化情況,畫出變化的曲線,曲線什么時候變得平坦了(到了平臺期)那個時間點應該就是最好的時間點(因為這個時候的細胞增殖抑制表現的最明顯)。


    4. 培養時間。200ul的培養液對于104~5次方的增殖期細胞來說,很難維持68h,如果營養不夠的話,細胞會由增殖期漸漸趨向G0期而趨于靜止,影響結果,我們是在48h換液的。


    5. MTT法只能測定細胞相對數和相對活力,不能測定細胞絕對數。做MTT時,盡量無菌操作,因為細菌 也可以導致MTT比色OD值的升高。


    6. 理論未必都是對的。要根據自己的實際情況調整。


    7. 實驗時應設置調零孔,對照孔,加藥孔。調零孔加培養基、MTT、二甲基亞砜 。對照孔和加藥孔都要加細胞、培養液、MTT、二甲基亞砜,不同的是對照孔加溶解藥物的介質,而加藥組加入不同濃度的藥物。


    8. 避免血清干擾。用含15%胎牛血清培養液培養細胞時,高的血清物質會影響試驗孔的光吸收值。由于試驗本底增加,會試驗敏感性。因此,一般選小于10%胎牛血清的培養液進行。在呈色后,盡量吸凈培養孔內殘余培養液。



    實驗步驟


    貼壁細胞:


    1. 收集對數期細胞,調整細胞懸液濃度,每孔加入100ul,鋪板使待測細胞調密度至1000-10000孔,(邊緣孔用無菌PBS填充)。


    2. 5%CO2,37℃孵育,至細胞單層鋪滿孔底(96孔平底板),加入濃度梯度的藥物,原則上,細胞貼壁后即可加藥,或兩小時,或半天時間,但我們常在前一天下午鋪板,次日上午加藥.一般5-7個梯度,每孔100ul,設3-5個復孔.建議設5個,否則難以反應真實情況


    3. 5%CO2,37℃孵育16-48小時,倒置顯微鏡下觀察。


    4. 每孔加入20ulMTT溶液(5mg/ml,即0.5%MTT),繼續培養4h。若藥物與MTT能夠反應,可先離心后棄去培養液,小心用PBS2-3遍后,再加入含MTT的培養液。


    5. 終止培養,小心吸去孔內培養液。


    6. 每孔加入150ul二甲基亞砜,置搖床上低速振蕩10min,使結晶物充分溶解。在酶聯免疫檢測儀OD490nm處測量各孔的吸光值。


    7. 同時設置調零孔(培養基、MTT、二甲基亞砜),對照孔(細胞、相同濃度的藥物溶解介質、培養液、MTT、二甲基亞砜)


    懸浮細胞:


    1. 收集對數期細胞,調節細胞懸液濃度1×106/ml,按次序將①補足的1640(無血清)培養基40ul ;②加Actinomycin D(有毒性)10ul用培養液稀釋 (儲存液100ug/ml,需預試尋找最佳稀釋度,110-120);③需檢測物10ul;④細胞懸液50ul(5×104cell/),共100ul加入到96孔板(邊緣孔用無菌水填充)。每板設對照(100ul 1640)。


    2. 置37℃,5%CO2孵育16-48小時,倒置顯微鏡下觀察。


    3. 每孔加入10 ul MTT溶液(5 mg/ml,即0.5%MTT),繼續培養4 h。(懸浮細胞推薦使用WST-1,培養4 h后可跳過步驟4),直接酶聯免疫檢測儀OD570nm(630nm校準)測量各孔的吸光值)


    4. 離心(1000x10min),小心吸掉上清,每孔加入100 ul二甲基亞砜,置搖床上低速振蕩10 min,使結晶物充分溶解。在酶聯免疫檢測儀OD570nm(630nm校準)測量各孔的吸光值。


    5. 同時設置調零孔(培養基、MTT、二甲基亞砜),對照孔(細胞、相同濃度的藥物溶解介質、培養液、MTT、二甲基亞砜),每組設定3復孔。


    推薦:RNA免疫沉淀常見問題解答

    來源:生物幫

     


    上一篇:北京大學陳英玉:細胞凋亡檢測方法
    下一篇:細胞因子對神經內分泌系統的影響
    分享到:
    ?
    <nav id="r8owu"></nav>
  • <wbr id="r8owu"><source id="r8owu"></source></wbr>

    <nav id="r8owu"><listing id="r8owu"><small id="r8owu"></small></listing></nav>
  • 午夜精品一区