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    Falck-Hillarp甲醛誘發熒光法

    Falck-Hillarp甲醛誘發熒光法

     

        去甲腎上腺素、腎上腺素、多巴胺、5―羥色胺、組胺等生物單胺類物質在組織內的含量甚微,需用高敏感性的技術方法才能在細胞水平顯示。生物胺熒光組織化學是在誘發熒光的基礎上建立的一種特異性強、敏感性高的技術方法。常用醛類誘發生物胺熒光的方法有Falck-Hillarp甲醛誘發熒光法、乙醛酸誘發生物單胺類熒光以及鄰苯二醛誘發組織胺熒光法。

     

        該法主要用于顯示兒茶酚胺(catecholamine,CA),如去甲腎上腺素、多巴胺及5―羥色胺等。

        1.原理  甲醛與兒茶酚胺等生物胺冰凍干燥后,先經過閉環作用,再經脫氧反應,形成3,4―二氫異喹啉,在適當pH下,后者成為互變異構醌型結構而產生強熒光,其最大激發波長和最大發射波長分別為410nm和480nm。

     

        2.組織標本制備

        (1)鋪片:對于富含交感神經支配的去甲腎上腺素能纖維的虹膜、腸系膜和皮下結締組織等可以制備鋪片。以虹膜為例,其鋪片過程如下:取出眼球,在解剖顯微鏡下盡量除去周圍結締組織,用虹膜剪沿眼球前部環形剪開,剔除晶狀體,將角膜向下置于清潔的載玻片上,再用鐘表鑷將虹膜從睫狀體撕下,將其在清潔的載玻片上鋪展成虹膜原本的形狀,用濾紙將周邊液體吸干后,置于含P2O5的真空干燥器內過夜。其他組織亦可采用同樣方法制作鋪片。

        (2)腦組織涂片:將小塊腦組織置于清潔載玻片上,用另外的載玻片呈銳角推過該腦組織,制作均勻的腦涂片,方法類似制作細胞涂片,干燥同前。腦涂片的組織結構雖較紊亂,但可通過熒光膨體測量兒茶酚胺含量,作為藥理學干預或損傷的一種快速普查法。

        (3)冰凍干燥法:取腦組織(1.0cm×0.5cm×0.5cm)置于OCT包埋劑內(可按切片需要調整組織塊方向),用液氮速凍,然后進行冷凍干燥,組織塊亦可在液氮中保存。已干燥的組織塊置P2O5的干燥器內再繼續干燥數天。

     

        3.甲醛處理  將已干燥的組織標本與含5g多聚甲醛的小器皿一同置入80%的烘箱內l―3小時,腎上腺素的反應較慢,需3小時左右,而后移至暗處,逐漸恢復至室溫(一般為25%)后,水溶性封片劑封片,熒光顯微鏡觀察。

     

        4.結果  兒茶酚胺中多巴胺、去甲腎上腺素神經元為黃綠色熒光,軸突前末梢較細胞體和膨體更易顯示;5-羥色胺神經元為黃色熒光。

     

        5.注意事項

        (1)多聚甲醛試劑含水量的多少對結果影響較明顯,含水量太少,所誘發的熒光弱,則顯示含單胺結構少,而含水量多時.熒光物質會發生彌散,所以,實驗前最好先將多聚甲醛經含水量恒定處理,即將一定量(如50g)的多聚甲醛置于適當大小的培養皿內與500ml硫酸(相對濕度為70%左右)共同置于干燥器中,蓋好干燥器蓋,室溫下放置7―10天。

        (2)如顯示5―羥色胺神經元,最好用單胺氧化酶抑制劑(如帕吉林,pargyline)預處理,再經5―羥色胺前體孵育,將有利于5―羥色胺神經元的顯示。

    來源:百度學術

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