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    初代細胞培養實驗

      初代培養或原代培養,是從供體獲取組織后的首次培養。其最大優點是:組織和細胞剛剛離體,生物性狀尚未發生很大的變化,具有二倍體遺傳性狀,在供體來源充分、生物條件穩定的情況下(年齡、性別),在一定程度上能 反  映體內狀態。

     實驗方法原理

     消化培養法

     合成培養基胰蛋白酶消化培養法,能把組織塊分散成細胞團或單個細胞,便于細胞從培養液中攝取營養和排出代謝產物,細胞能較快地長成單層。
      本法尤適用于培
    養大量組織,細胞產量高;但用于經常性小量培養工作稍顯繁瑣,無菌操作不良時且易污染。


      實驗材料

      組織


      試劑、試劑盒

      Hanks  培養液  胰蛋白酶


     儀器、耗材

      吸管 平皿 培養瓶 燒杯 攪拌器 三角燒瓶 不銹鋼篩 眼科剪 眼科鑷 計數板


      實驗步驟

      1.  準備
      取各種已消毒的培養用品置于凈化臺面,紫外線消毒20 分鐘;


      2.  布局
      點燃酒精燈(或煤氣燈),安裝吸管帽(應通過火焰);

      3.  處理組織
       把組織塊置入燒杯中,用Hanks液漂洗2~3 次,去除血污;如
    懷疑組織可能污染,可先置于含有青鏈霉素的混合液中30~60 分鐘;

      4.  剪切
      用眼科剪把組織塊切成2~3 毫米大小的塊(用手術刀割亦可),以
    便于消化;加入比組織塊總量多30~50 倍的胰蛋白酶液,然后一并倒入三角燒瓶中,結扎瓶口或塞以膠塞;

      5.  消化
      或用恒溫水浴,或置入37 ℃溫箱消化均可,消化中每隔20 分鐘應搖
    動一次,如用電磁恒溫攪拌器消化更好(消化前瓶中需置一無菌攪棒);消化時間依組織塊的大小和組織的硬度而定;

      6.  分離
      在消化過程中見消化液發混濁時,可用吸管吸出少許消化液在鏡下
    觀察,如組織已分散成細胞團或單個細胞,立即終止消化,隨即通過適宜不銹鋼篩,濾掉尚未充分消化開的組織塊(必要時可繼續進行消化);低速  (500~1000 轉/分)離心消化液5 分鐘,吸出上清,加入適量含有血清的培養液(如有其它酶或EDTA 等消化,需用Hanks液洗脫一兩次后,再加入培養液);

      7.  計數
      用計數板計數,如細胞懸液細胞密度過大,再補加培養液調整后,
    分裝入培養瓶中;對大多數細胞來說,pH 要求在7.2~7.4范圍,培養液呈微紅色,如顏色偏黃,說膽液體變酸,可用NaHCO3調整;

      8.  培養
      置入36.5 ℃溫箱培養;如用CO2溫箱培養,瓶口需用紗布棉塞或螺
    旋帽(松口)堵塞,紗布塞易生霉菌,每次換液時需更換新塞。


    注意事項

       1 組織塊、胰蛋白酶、培養液等易受紫外線傷害的物品,最好在培養時再攜入操作野;如預先置入,需用紙張覆蓋,以免受射線影響;開始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部(工作時宜挽上袖口)


    此文轉載來源:丁香通



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