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    大鼠乳鼠成骨細胞培養實驗

          大鼠乳鼠成骨細胞培養培養可以:(1)獲得大鼠乳鼠成骨細胞;(2)用于骨修復的細胞學機制研究。


    實驗方法原理

           取材于出生2~3 d 小鼠顱骨,以含20%胎牛血清的DMEM培養液進行培養,采用膠原酶消化法分離成骨細胞,并進行細胞接種與傳代。采用膠原酶消化法分離培養成骨細胞是一種可靠、簡便、快速的細胞原代分離培養方法。


    實驗材料

          SD大鼠


    試劑、試劑盒

          F12 完全培養液   胰蛋白酶   Ⅱ型膠原酶   酒精


    儀器、耗材

           手術器械   磁力攪拌器

     

     

                                                        此文轉載:丁香通



    實驗步驟

    一、實驗步驟


          1.  拉頸處死24 小時內新生的SD大鼠,75%乙醇浸泡5 min,取出頭蓋骨,分離頂骨和額骨,冰生理鹽水液反復洗滌大鼠乳鼠顱蓋骨標本除去脂肪組織及殘留血,放入另一盛有F12 完全培基液的培養皿中再洗滌, 將顱骨剪成2~5 mm碎片,將洗滌過的骨碎片用 0.25%胰蛋白酶2 ml 預消化15 min,以清除纖維組織細胞,棄去上清液(其中主要含成纖維細胞)。

          2.  然后以0.1%  Ⅱ型膠原酶10 ml,在37℃環境中消化 20 分鐘,室溫下磁力攪拌消化20 分鐘。靜置數分鐘,收集消化液,室溫下以1200 rpm離心10 分鐘。去除上清液,用20% 胎牛血清的F12 培養液4 ml 懸 浮細胞,接種于75 ml 培養瓶中,補培養液8 ml 使每瓶液體量達到12 ml;對靜置后沉淀部分可再重復以膠原酶消化20 分鐘、磁力攪拌消化15 分鐘、離心10 分鐘,將獲得的3 瓶細胞放置于二氧化碳培養箱,在5% CO2,95%空氣,37℃溫度下培養,24 小時后可見細胞貼壁生長,胞質開始伸展,換新鮮培養液,以后每隔48 小時換培養液(注:消化視具體情況而定,也可多消化 1 遍)。

          3.  原代培養一般接種后第7 天能長滿。傳代時,取生長良好、貼壁松緊適度的成骨細胞 1 瓶,棄去培養 液,傳代時先以 PBS 沖洗 2 遍,加 0.25%胰酶1 ml,室溫下消化3~5 分鐘,將胰蛋白酶液棄去,加 F12 培養液充分吹打8-10 分鐘。將已消化的細胞收集、合并,計數;用 F12 完全培基調節至細胞濃度為合適濃 度。一般取2-5 代成骨細胞進行實驗。代數太多,細胞老化或者分化明顯。
     
    二、結果
          如圖所示,成骨細胞的形狀和成纖維細胞非常相似,但是不同的是,比成纖維細胞更不容易消化,尤 其是傳代次數多,細胞老化的時候,非常難消化,并且不易消化成單個細胞。
     
    圖1:成骨細胞
    圖2:成骨細胞100倍
     

    圖3:成骨細胞形成的礦化結節

    三、鑒定的方法
          1.  堿性磷酸酶(ALP)活性檢測
          2.  骨玻璃樣蛋白(BGP)檢測

          3.  礦化結節檢測



    其他


    一、討論

          成骨細胞包繞在硬組織中,致使處理困難,可采用骨組織塊法、酶消化法、骨膜組織塊法、 骨髓培養法以及薄層骨片經 EDTA 處理并經膠原酶消化,均可培養出成骨細胞。體外培養的成骨細胞保持 有骨組織細胞的某些特征。據文獻報道,不同方法培養的成骨細胞形態是不同的[1]。
     
    二、文獻

          [1]  司徒鎮強. 細胞培養 [M]. 第一版. 西安. 世界圖書出版社西安公司, 2000:115.


    此文轉載來源:丁香通



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