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    細胞凋亡誘導


      【實驗方法與步驟】


            1)細胞凋亡的誘導:HeLa細胞常規傳代培養至對數生長期(見細胞傳代培養)。實驗組細胞加入順鉑溶液(生理鹽水配置)至終濃度為20μmo1/L,37℃,5% CO2條件下繼續培養??瞻讓嶒瀸φ占尤氲润w積的生理鹽水,  同樣條件繼續培養。24h后進行染色及形態學觀察。

            2)胰酶消化細胞,將培養基上清及消化下來的細胞一同轉入離心管中600~800r/min離心10min。

           3)吸去上清,用1mL PBS重懸細胞沉淀,并轉入1.5mL微量離心管中,600~800r/min離心10min。

            4)吸去上清,用500μL PBS重量細胞沉淀,取178μL轉入0.5mL的微量離心管中,加入PI 20μL(終濃度100μg/mL),Hoechest 33342 2μL(終濃度10μg/mL),混勻,37℃溫箱中避光標記15min。

            5600~800r/min離心10min,棄上清,加50μL PBS重懸細胞。

            6)分別從實驗組及對照組中取10μL細胞懸液滴于載玻片上,蓋上蓋玻片。

            7)熒光顯微鏡20倍物鏡在紫外光激發下觀察,可觀察到凋亡細胞核形態發生明顯的改變,出現染色質凝集及邊緣化。

      【注意事項】

            1)誘導細胞凋亡后收集細胞時,注意要同時收集細胞培養基上清液。

            2)懸浮細胞時動作要輕柔,避免損傷細胞。

            3)在實驗中可同時設計壞死細胞的對照,例如,取正常細胞經低滲后進行染色觀察。


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