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    酶聯免疫吸附試驗

          酶聯免疫技術是將抗原抗體反應的特異性與酶促反應的專一性和敏感性結合而形成的一種方法。這是一種固相酶免疫檢測技術,始創于1971年。它既可用于測定抗原,又可用于測定抗體。其敏感性高,特異性強,已成為酶免疫技術中應用最廣泛的一種方法。本實驗以雙抗夾心法檢測乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)為例。


    【實驗目的】

          通過本實驗的學習,了解酶聯免疫吸附的基本原理及其用途,并熟悉其操作步驟與技能。


    【實驗原理】

          酶聯免疫吸附試驗是以免疫學反應為基礎,將酶(如辣根過氧化物酶,HRP)標記到抗體或抗原分子上,利用微孔塑料反應板能吸附蛋白質的特性,將可溶性抗原或抗體吸附于反應孔表面,然后用酶標記的抗體或抗原與其特異性結合,洗去游離抗原或抗體,最后加入酶作用底物。由于酶分解底物而顯色,根據底物顏色深淺來判斷標本中特異性抗原或抗體的量。


    【試劑與器材】

          1. 待測抗原、抗體(馬抗HBsAg)和酶標記抗體(HRP-HBsAg)。

          2. 正常人血清和陽性對照血清。

          3. 包被緩沖液(0.05M  pH9.6碳酸鹽緩沖液)。

          Na2CO3     1.59g

          NaHCO3      2.93g

          加蒸餾水至1000ml

          4. 洗滌緩沖液(0.15M  pH7.4  PBS0.05% Tween-20)。

          5. 底物緩沖液。

          0.1mol/L檸檬酸(2.1g/100ml6.1ml

          0.2mol/L Na2HPO4·12H2O7.163g/100ml6.4mL

          加入12.5ml蒸餾水,將10mgOPD溶于其中,待溶解后,臨用前加30%H2O。

          6. 終止液(2M H2SO4)。

          7. 加樣器、微孔板、酶標檢測儀。


    【實驗方法與步驟】

          1. 包被:用0.05M pH9.6 碳酸鹽包被緩沖液將抗體稀釋至蛋白質含量為110μgml。在每個聚苯乙烯板的反應孔中加0.1ml,4℃ 過夜。次日,棄去孔內溶液,用洗滌緩沖液洗3次,于吸水紙上扣干水分。

          2. 加樣:加待測抗原0.1ml于上述已包被之反應孔中,置37℃ 孵育1h。然后洗滌3次,扣干水分。(同時做空白孔,陰性對照孔及陽性對照孔)。

          3. 加酶標抗體:于各反應孔中,加入新鮮稀釋的酶標抗體0.1ml。37℃ 孵育0.51h,洗滌。

          4. 加底物液顯色:于各反應孔中加入臨時配制的OPD底物溶液0.1ml,37 1030min。

          5. 終止反應:于各反應孔中加入0.05ml終止液。

           6. 結果判定:可于白色背景上,直接用肉眼觀察結果:反應孔內顏色越深,陽性程度越強,陰性反應為無色或極淺,依據所呈顏色的深淺,以“+”、“-”號表示。也可在酶標檢測儀上,于492nm處,以空白對照孔調零后測各孔OD值,若大于規定的陰性對照OD值的2.1倍,即為陽性。


    【注意事項】

          1. 試驗時,應分別以陽性對照與陰性對照控制試驗條件,待檢樣品應作一式二份,以保證實驗結果的準確性。有時本底較高,說明有非特異性反應,可采用羊血清、兔血清或BSA等封閉。

          2. 洗滌時確保洗滌干凈,避免假陽性。


    【思 考 題】

          1. 在對流免疫電泳中為什么抗體會向陰極移動?

          2. 酶聯免疫吸附法有哪幾種類型,其原理是什么?


          此文轉載來源:百度文庫


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