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    流式細胞儀檢測技術實驗
    實驗方法原理
    流式細胞儀的使用一般分為三個步驟。第一,是儀器前階段,包括試劑的準備,細胞制備、細胞的熒光染色;第二,是流式細胞儀階段,主要是儀器的操作;第三,是結果分析階段。
    實驗材料 淋巴細胞外周血的白細胞
    試劑、試劑盒 FACS緩沖液PBS疊氮鈉溶液儀器緩沖液FACS清潔液FACS洗凈液
    儀器、耗材 流式細胞儀
    實驗步驟
    一、 細胞和試劑的準備

    1.  細胞樣品:來源淋巴細胞或外周血的白細胞。

    2.  熒光標記單克隆抗體:常用的有FITC(fluorescein -isothiocyanate)和PE(phycoerythrin)標記的單克隆抗體。

    3.  封閉抗體:抗Fc受體抗體
     
    4.  FACS緩沖液:
    1×PBS  950 ml
    FCS  40 ml
    10%疊氮鈉溶液  10 ml

    5.  儀器緩沖液(FACS-flow):儀器廠家提供

    6.  FACS清潔液(FACS clean )和FACS洗凈液(FACS rinse):儀器廠家提供。

    二、操作步驟
     
    1.  單細胞懸液的制備:將1×105~1×107的細胞放入1.5 m l離心管中3000 r/min 離心5分鐘,棄上清;加入FACS緩沖液100 μl 懸浮細胞。

    2.  封閉細胞表面Fc受體:在步驟1中加入Fc受體抗體0.5 μl(0.5 mg/ml),水浴3分鐘。

    3.  細胞與熒光抗體結合:在步驟2中加入熒光抗體1 μl(0.5 mg/ml),水浴30分鐘。

    4.  洗細胞去除游離的熒光抗體:在步驟3中加入FACS緩沖液350 μl,輕輕混勻,3000 r/min,離心5分鐘,棄上清,重復步驟(4)2次。

    5.  上樣前處理:取100 μl 儀器緩沖液加入步驟(4)獲得的細胞沉淀中,輕輕混勻懸浮細胞,將細胞懸液移入FACS專用管中,準備進行儀器檢測和分析。

    三、儀器的操作

    以FACSCaliburTM(BD Biosciences)儀器為例。儀器主要分為主機部分(包括激光激活源,射流,射線探測器)和計算機部分(CELLQuest softwere)。儀器的操作分為使用前的準備、使用中的操作和使用后的清洗。

    1.使用前的準備

    (1)打開電源:包括系統電源和主機部分電源。

    (2)檢查供液槽和廢液槽:供液槽應含足夠的儀器緩沖液,廢液槽應在上次使用后清洗干凈。

    (3)使機器處于負亞狀態,才能使細胞懸液被吸入至機器的吸管口。

    (4)機器處于可應用狀態時,指示燈會變成綠色。

    2.使用中的操作

    (1) 計算機部分—使用CELLQuest程序系統軟件:

    ①設定所要檢測細胞的數量:一般設10 000~20 000個細胞。

    ②命名本次實驗:一般含使用者的姓名和實驗日期。

    ③打開記數部分:顯示進入的細胞數以及檢測一定量的細胞所需要的時間。

    ④將微機與主機連接:控制檢測時的預檢測和實際檢測。

    ⑤主機設定:一般是已設定好的適合測定淋巴細胞的條件,包括探測器的電壓。探測器的電壓是調空光電倍增管所能檢測熒光密度的范圍。

    ⑥選擇檢測的波長和表達方式(plot):如果用一種熒光抗體,一般選直方圖(histogram);如果用兩種熒光抗體,常選點狀二維圖(dot plot)或輪廓線圖(contour plot)表

     CD69分子表達檢測直方圖的數值說明


     

    b.abti-CD3(2 ng/ml)檢測結果


     

     
    c.abti-CD3(10 ng/ml)檢測結果
     

     
    CD4及CD8細胞點狀二維圖結果
     

     
    不同的熒光物要求選擇不同的激發波長,參見下表
     

     
    (2)細胞的吸入:將裝有細胞的FACS測定管放置到機器吸管孔處。
    先預檢測樣品,然后進行實際檢測??筛鶕毎臐舛冗x擇測定的速度(低、中或高)。所有的數據將自動存入微機。

    3.使用后的清洗  所有樣品測定完后,要進行儀器的清洗。

    (1)將裝FACS清潔液的FACS管放置機器吸管孔,高速吸入1分鐘。

    (2)將裝FACS洗凈液的FACS管放置機器吸管孔,高速吸入 1分鐘。

    (3)再將裝FACS清潔液的FACS管放置機器吸管孔,高速吸入5分鐘。

    (4)同樣再將裝FACS洗凈液的FACS管放置機器吸管孔,高速吸入5分鐘。

    (5)最后將一裝有雙蒸水的FACS管放置機器吸管孔后,關閉機器。

    (6)將廢液槽中的廢液倒掉,并清洗干凈廢液槽。
    收起 
    注意事項
    1.  減少非特異熒光染色

    (1)細胞的活性和狀態:流式細胞儀不但可探測細胞表面的熒光,也可探測細胞內的熒光。因此,如果要檢測細胞表面的分子,一定要保證細胞的活性,還應盡可能保持細胞靜止,通常在4度進行操作。否則,熒光抗體進入死細胞內,會產生非特異結果。

    (2)封閉抗體的應用是必不可少的,因為大多數的免疫細胞表面都表達有Fc-R。細胞與抗體相互作用后,一定要用FACS緩沖液洗2~3次,以除去游離的抗體。

    2.  單染色時以FACS最常用,FITC標記抗體熒光比較穩定而且價格合適。

    3.  如果同時要檢測兩種以上的分子,一定要選擇不同波長的熒光所標記的抗體。
     
    收起 
    其他
    流式細胞儀(flow cytometer)是一種能夠探測和計數以單細胞液體流形式穿過激光束的細胞檢測裝置,由于在檢測中使用的細胞標志示蹤物質為熒光標記物,因此,用來分離、鑒定細胞的流式細胞儀有被稱為熒光激活細胞分類儀,是分離和鑒定細胞群及亞群的一種強而有力的應用工具。
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