細胞免疫熒光步驟
發布人：管理員 瀏覽次數： 發布時間：2018-12-18
實驗方法原理 ： 在進行細胞免疫熒光過程中，需要用到細胞爬片，通過將爬片浸在細胞培養基內，細胞在爬片上生長，進而進行細胞的免疫熒光。
實驗材料： 細胞樣品
試劑、試劑盒 ： 多聚甲醛 70%甲醇 丙酮 PBS Triton BSA DAPI染液 DABCO Tris 甘油
儀器、耗材： 玻片
實驗步驟
細胞爬片免疫熒光實驗步驟
第一天：
1. 在培養板中將已爬好細胞的玻片用PBS浸洗3次，每次3min；
2. 用4%的多聚甲醛固定爬片15min， PBS浸洗玻片3次，每次3min；
3. 0.5%Triton X-100( PBS配制 )室溫通透20min（細胞膜上表達的抗原省略此步驟）；
4. PBS浸洗玻片3次，每次3 min，吸水紙吸干PBS，在玻片上滴加正常山羊血清，室溫封閉30min；
5. 吸水紙吸掉封閉液，不洗，每張玻片滴加足夠量的稀釋好的一抗并放入濕盒，4℃孵育過夜；
第二天：
6. 加熒光二抗： PBST 浸洗爬片3次，每次3min，吸水紙吸干爬片上多余液體后滴加稀釋好的熒光二抗，濕盒中20-37℃孵育1h，PBST浸洗切片3次，每次3min；注意：從加熒光二抗起，后面所有操作步驟都盡量在較暗處進行。
7. 復染核：滴加DAPI避光孵育5min，對標本進行染核，PBST 5min×4次洗去多余的DAPI；8. 用吸水紙吸干爬片上的液體，用含抗熒光淬滅劑的封片液封片，然后在熒光顯微鏡下觀察采集圖像。
注意事項
1.取細胞爬片時，動作應輕柔，防止將細胞爬片夾碎，影響實驗進程。
2.種細胞過程中，要注意將細胞輕柔混勻，“八”字或者“十”字形搖晃，防止細胞局部生長過密。
實驗材料： 細胞樣品
試劑、試劑盒 ： 多聚甲醛 70%甲醇 丙酮 PBS Triton BSA DAPI染液 DABCO Tris 甘油
儀器、耗材： 玻片
實驗步驟
細胞爬片免疫熒光實驗步驟
第一天：
1. 在培養板中將已爬好細胞的玻片用PBS浸洗3次，每次3min；
2. 用4%的多聚甲醛固定爬片15min， PBS浸洗玻片3次，每次3min；
3. 0.5%Triton X-100( PBS配制 )室溫通透20min（細胞膜上表達的抗原省略此步驟）；
4. PBS浸洗玻片3次，每次3 min，吸水紙吸干PBS，在玻片上滴加正常山羊血清，室溫封閉30min；
5. 吸水紙吸掉封閉液，不洗，每張玻片滴加足夠量的稀釋好的一抗并放入濕盒，4℃孵育過夜；
第二天：
6. 加熒光二抗： PBST 浸洗爬片3次，每次3min，吸水紙吸干爬片上多余液體后滴加稀釋好的熒光二抗，濕盒中20-37℃孵育1h，PBST浸洗切片3次，每次3min；注意：從加熒光二抗起，后面所有操作步驟都盡量在較暗處進行。
7. 復染核：滴加DAPI避光孵育5min，對標本進行染核，PBST 5min×4次洗去多余的DAPI；8. 用吸水紙吸干爬片上的液體，用含抗熒光淬滅劑的封片液封片，然后在熒光顯微鏡下觀察采集圖像。
注意事項
1.取細胞爬片時，動作應輕柔，防止將細胞爬片夾碎，影響實驗進程。
2.種細胞過程中，要注意將細胞輕柔混勻，“八”字或者“十”字形搖晃，防止細胞局部生長過密。
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