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    細胞免疫熒光步驟

    驗方法原理  

    在進行細胞免疫熒光過程中,需要用到細胞爬片,通過將爬片浸在細胞培養基內,細胞在爬片上生長,進而進行細胞的免疫熒光。

    實驗材料 細胞樣品

    試劑、試劑盒 : 多聚甲醛  70%甲醇  丙酮  PBS  Triton   BSA  DAPI染液  DABCO  Tris  甘油
    儀器、耗材: 玻片
    實驗步驟
    細胞爬片免疫熒光實驗步驟
    第一天:
    1. 在培養板中將已爬好細胞的玻片用PBS浸洗3次,每次3min;
    2. 用4%的多聚甲醛固定爬片15min, PBS浸洗玻片3次,每次3min;
    3. 0.5%Triton X-100( PBS配制 )室溫通透20min(細胞膜上表達的抗原省略此步驟);
    4. PBS浸洗玻片3次,每次3 min,吸水紙吸干PBS,在玻片上滴加正常山羊血清,室溫封閉30min;
    5. 吸水紙吸掉封閉液,不洗,每張玻片滴加足夠量的稀釋好的一抗并放入濕盒,4℃孵育過夜;
    第二天:
    6. 加熒光二抗: PBST 浸洗爬片3次,每次3min,吸水紙吸干爬片上多余液體后滴加稀釋好的熒光二抗,濕盒中20-37℃孵育1h,PBST浸洗切片3次,每次3min;注意:從加熒光二抗起,后面所有操作步驟都盡量在較暗處進行。
    7. 復染核:滴加DAPI避光孵育5min,對標本進行染核,PBST 5minx4次洗去多余的DAPI;8. 用吸水紙吸干爬片上的液體,用含抗熒光淬滅劑的封片液封片,然后在熒光顯微鏡下觀察采集圖像。
    注意事項
    1.取細胞爬片時,動作應輕柔,防止將細胞爬片夾碎,影響實驗進程。
    2.種細胞過程中,要注意將細胞輕柔混勻,“八”字或者“十”字形搖晃,防止細胞局部生長過密。
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