目的:通過CRISPR/Cas9技術獲得肌肉特異性表達Cas9蛋白小鼠胚胎,為建立肌肉特異表達Cas9 小鼠動物模型奠定基礎?

方法:設計小鼠 Rosa26位點sgRNA并通過體外酶切驗證活性,同時使用同源重組構建 肌肉特異性同源打靶載體;通過顯微注射將 Rosa26sgRNA與Cas9蛋白注射到小鼠胚胎,通過PCR及測序檢測胚 胎的編輯情況,同時移植到假孕母鼠體內,待其生產;將同源打靶載體與 Rosa26sgRNA和Cas9一起注射到小鼠胚 胎,通過PCR檢測整合情況?

結果:體外酶切實驗表明,體外轉錄的sgRNA與Cas9蛋白聯合可對靶位點產生編 輯作用;成功構建了肌肉特異性同源打靶載體Donor-SP-px459;通過原核注射獲得 Rosa26基因編輯胚胎,經移植獲 得 Rosa26基因編輯小鼠;注射同源打靶載體后,成功獲得肌肉特異表達Cas9蛋白的基因打靶小鼠胚胎?

結論:利 用CRISPR/Cas9技術,成功獲得 Rosa26基因編輯胚胎和小鼠,并獲得了肌肉特異性表達Cas9蛋白小鼠胚胎,為利 用基因打靶構建肌肉特異表達Cas9的小鼠動物模型奠定基礎?