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  • MHC 四聚體技術:檢測抗原特異性T細胞的金標準

           細胞在腫瘤、病毒、細菌、寄生蟲、移植組織、過敏原、甚至自身抗原的適應性免疫應答中都發揮著重要的調節作用。大部分 T 淋巴細胞在其細胞表面表達單一的、高度特異性的抗原受體(TCR),與 MHC-抗原肽復合物相結合并識別其中特異的抗原肽,啟動獲得性/特異性免疫應答機制,比如 T 細胞介導的細胞免疫和 B 細胞介導的體液免疫。
           由于 TCR 與 MHC-抗原肽復合物之間的親和力低,半衰期短,相互結合后容易快速脫落,重組的可溶性 MHC-抗原肽復合物單體并不適合用于抗原特異性的 T 細胞檢測。
           1996 年,美國斯坦福大學 John D. Altman 博士等人開發出 MHC-抗原肽復合物四聚體(簡稱:MHC 四聚體)技術。該技術由 4 個 MHC-抗原肽單體分子及熒光染料組成的復合物,它以帶有信號標記的鏈霉親合素為基礎,交聯四個 MHC 分子單體,形成 MHC 四聚體;一個 MHC 四聚體分子可與同一 T 細胞表面的 3-4 個 TCR 相識別并結合,從而大大增強了 MHC-抗原肽復合物與 TCR 之間的結合力和檢測特異性,并可通過流式細胞術成功實現對抗原特異性的 T 細胞的離體分析。

           如今,MHC 四聚體技術已成為 T 細胞免疫應答定量的「金標準」。它極高的靈敏度和抗原特異性,適用于一些相關的基礎研究和臨床應用,包括:特異性 T 細胞高效分選;抗原表位短肽親和力篩選;病毒逃避免疫機制研究;T 細胞表面受體 TCR 親和力研究;可作為分子標記,應用于「T-Cell Receptor-Like Antibodies」篩選研究;MHC 免疫功能研究等。

           MHC 四聚體已廣泛應用于疫苗研發;細胞治療研究等。并具備診斷試劑開發潛能。
           四聚體技術優勢
           與其他應用于 T 細胞檢測的傳統方法相比,如酶聯免疫斑點檢測(ELISPOT)、單細胞 PCR 等,MHC 四聚體分析技術具有以下優勢:

           高靈敏度:可檢測血液中低豐度(≤1%)的抗原特異性 T 細胞

           高特異性:極大提高了 TCR 與 MHC-抗原多肽復合物結合的特異性

           穩定性好:檢測結果一致性好,可重復性高

           多樣化/個性化:可定制,合成特異的抗原多肽片段,組合成各種 T 細胞選擇性 MHC 四聚體

           定性/定量分析:可結合流式細胞術實現對抗原特異性 T 細胞群的定性/定量分析

           熒光標記選擇靈活: 可選用 PE 或者 APC 標記

           HelixGen MHC 四聚體試劑染色步驟

           (一)所需主要試劑和設備
           1)欲檢測的細胞或全血;
           2)熒光染料標記 Anti-CD8 抗體或其它抗體;
           3)離心機、流式細胞分選儀等。
           (二)基本操作流程
           細胞準備
           1.外周血單核細胞、脾細胞、淋巴細胞、常規細胞系細胞等,以 2-5×107/ml 的密度重懸于 FACS Buffer(PBS+ 2% 小牛血清+0.1% 疊氮鈉;建議使用時新鮮配制),制備成細胞懸浮液。
           2.取 25ul 細胞懸浮液滴加入微孔培養板或 FACS 試管。
           Staining Cocktail 制備
           3.制備 2X Staining Cocktail:FACS Buffer+ MHC 四聚體(建議稀釋比例為 1:50~1:100)+ Anti-CD8/FITC 抗體或其他用作內參的抗體(請參考其說明書進行稀釋)。
           染色孵育
           4.取 25ul 2X Staining Cocktail,滴加入步驟 2 中的微孔培養板或 FACS 試管,與細胞懸浮液混勻。(注意:使用移液器輕柔上下吹打混勻,盡可能避免產生氣泡。)

           5.在冰上或其他已通過實驗優化確認的最佳溫度條件下,避光孵育 60 分鐘。
    洗滌
           6、加入 150ul FACS Buffer 至微孔培養板每孔或 2-3 ml FACS Buffer 至 FACS 試管,輕柔混勻,避免形成氣泡,1200 rpm 離心 5 min,小心除去上清液,盡可能不要觸碰到細胞沉淀,減少細胞損失。(注意:對于具有傳染性或危害性的樣本,可考慮使用吸引器,輕柔吸掉上清液,盡可能不要觸碰到細胞沉淀,減少細胞損失。)

           7、重復步驟 6,再洗滌 2 次。
           細胞固定&流式分析
           8、將細胞重懸于 200ul 固定液(PBS+1% 多聚甲醛(PFA))中,使用流式細胞儀進行樣本分析。
           HelixGen MHC 四聚體試劑染色注意事項
           1.染色體系的體積應盡可能小,以節約試劑。例如:25ul 2X Staining Cocktail + 25ul 細胞懸浮液=50ul。
           2.所有操作應盡量在 4℃ 條件下進行。一些 MHC 四聚體在室溫或更高溫度條件下,能獲得更高強度的親和力,可提高染色效果。但另一些細胞表面標志物,比如 CD62L,對較高的溫度條件往往比較敏感。部分 MHC 四聚體已被證實,在 37℃ 條件下容易與細胞解離。故我們建議:在 4℃ 條件下孵育 45-60 分鐘,或在室溫條件下孵育 30 分鐘。

           3.在進行大規模試驗前,建議先進行預試驗,以確定最佳的 MHC 四聚體稀釋比例。通常,建議 MHC 四聚體的初始稀釋比例為 1:100~1:200。請根據具體實驗,優化其稀釋比例,以期獲得最佳的染色效果。
           4.對于新鮮的外周血單核細胞、淋巴細胞、脾細胞,通常建議每個染色樣品細胞總數為 1-2 ×106;而對于細胞克隆或者 CTL 細胞系,每個樣品細胞總數可減低為 2×105。當針對細胞克隆染色時,建議選取具有不同特異性的其它克隆細胞作為陰性對照。
           HelixGen MHC 四聚體定制服務流程
           細胞在腫瘤、病毒、細菌、寄生蟲、移植組織、過敏原、甚至自身抗原的適應性免疫應答中都發揮著重要的調節作用。大部分 T 淋巴細胞在其細胞表面表達單一的、高度特異性的抗原受體(TCR),與 MHC-抗原肽復合物相結合并識別其中特異的抗原肽,啟動獲得性/特異性免疫應答機制,比如 T 細胞介導的細胞免疫和 B 細胞介導的體液免疫。
           由于 TCR 與 MHC-抗原肽復合物之間的親和力低,半衰期短,相互結合后容易快速脫落,重組的可溶性 MHC-抗原肽復合物單體并不適合用于抗原特異性的 T 細胞檢測。
           1996 年,美國斯坦福大學 John D. Altman 博士等人開發出 MHC-抗原肽復合物四聚體(簡稱:MHC 四聚體)技術。該技術由 4 個 MHC-抗原肽單體分子及熒光染料組成的復合物,它以帶有信號標記的鏈霉親合素為基礎,交聯四個 MHC 分子單體,形成 MHC 四聚體;一個 MHC 四聚體分子可與同一 T 細胞表面的 3-4 個 TCR 相識別并結合,從而大大增強了 MHC-抗原肽復合物與 TCR 之間的結合力和檢測特異性,并可通過流式細胞術成功實現對抗原特異性的 T 細胞的離體分析。
           如今,MHC 四聚體技術已成為 T 細胞免疫應答定量的「金標準」。它極高的靈敏度和抗原特異性,適用于一些相關的基礎研究和臨床應用,包括:特異性 T 細胞高效分選;抗原表位短肽親和力篩選;病毒逃避免疫機制研究;T 細胞表面受體 TCR 親和力研究;可作為分子標記,應用于「T-Cell Receptor-Like Antibodies」篩選研究;MHC 免疫功能研究等。
           MHC 四聚體已廣泛應用于疫苗研發;細胞治療研究等。并具備診斷試劑開發潛能。
           四聚體技術優勢
           與其他應用于 T 細胞檢測的傳統方法相比,如酶聯免疫斑點檢測(ELISPOT)、單細胞 PCR 等,MHC 四聚體分析技術具有以下優勢:
           高靈敏度:可檢測血液中低豐度(≤1%)的抗原特異性 T 細胞

           高特異性:極大提高了 TCR 與 MHC-抗原多肽復合物結合的特異性

           穩定性好:檢測結果一致性好,可重復性高

           多樣化/個性化:可定制,合成特異的抗原多肽片段,組合成各種 T 細胞選擇性 MHC 四聚體

           定性/定量分析:可結合流式細胞術實現對抗原特異性 T 細胞群的定性/定量分析

           熒光標記選擇靈活: 可選用 PE 或者 APC 標記
           HelixGen MHC 四聚體試劑染色步驟

           (一)所需主要試劑和設備
           1)欲檢測的細胞或全血;

           2)熒光染料標記 Anti-CD8 抗體或其它抗體;
           3)離心機、流式細胞分選儀等。
           (二)基本操作流程
           細胞準備
           1.外周血單核細胞、脾細胞、淋巴細胞、常規細胞系細胞等,以 2-5×107/ml 的密度重懸于 FACS Buffer(PBS+ 2% 小牛血清+0.1% 疊氮鈉;建議使用時新鮮配制),制備成細胞懸浮液。

           2.取 25ul 細胞懸浮液滴加入微孔培養板或 FACS 試管。
           Staining Cocktail 制備
           3.制備 2X Staining Cocktail:FACS Buffer+ MHC 四聚體(建議稀釋比例為 1:50~1:100)+ Anti-CD8/FITC 抗體或其他用作內參的抗體(請參考其說明書進行稀釋)。
    染色孵育
           4.取 25ul 2X Staining Cocktail,滴加入步驟 2 中的微孔培養板或 FACS 試管,與細胞懸浮液混勻。(注意:使用移液器輕柔上下吹打混勻,盡可能避免產生氣泡。)

           5.在冰上或其他已通過實驗優化確認的最佳溫度條件下,避光孵育 60 分鐘。
    洗滌
           6、加入 150ul FACS Buffer 至微孔培養板每孔或 2-3 ml FACS Buffer 至 FACS 試管,輕柔混勻,避免形成氣泡,1200 rpm 離心 5 min,小心除去上清液,盡可能不要觸碰到細胞沉淀,減少細胞損失。(注意:對于具有傳染性或危害性的樣本,可考慮使用吸引器,輕柔吸掉上清液,盡可能不要觸碰到細胞沉淀,減少細胞損失。)

           7、重復步驟 6,再洗滌 2 次。
    細胞固定&流式分析
           8、將細胞重懸于 200ul 固定液(PBS+1% 多聚甲醛(PFA))中,使用流式細胞儀進行樣本分析。
           HelixGen MHC 四聚體試劑染色注意事項
           1.染色體系的體積應盡可能小,以節約試劑。例如:25ul 2X Staining Cocktail + 25ul 細胞懸浮液=50ul。
           2.所有操作應盡量在 4℃ 條件下進行。一些 MHC 四聚體在室溫或更高溫度條件下,能獲得更高強度的親和力,可提高染色效果。但另一些細胞表面標志物,比如 CD62L,對較高的溫度條件往往比較敏感。部分 MHC 四聚體已被證實,在 37℃ 條件下容易與細胞解離。故我們建議:在 4℃ 條件下孵育 45-60 分鐘,或在室溫條件下孵育 30 分鐘。
           3.在進行大規模試驗前,建議先進行預試驗,以確定最佳的 MHC 四聚體稀釋比例。通常,建議 MHC 四聚體的初始稀釋比例為 1:100~1:200。請根據具體實驗,優化其稀釋比例,以期獲得最佳的染色效果。
           4.對于新鮮的外周血單核細胞、淋巴細胞、脾細胞,通常建議每個染色樣品細胞總數為 1-2 ×106;而對于細胞克隆或者 CTL 細胞系,每個樣品細胞總數可減低為 2×105。當針對細胞克隆染色時,建議選取具有不同特異性的其它克隆細胞作為陰性對照。(轉載)

           想了解更多相關信息,請關注: http://www.35ai.cn/

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